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改良一步法微量淋巴细胞毒交叉试验
淋巴细胞毒交叉试验也称补体依赖细胞毒试验(CDC)。它是检查器官移植受者体内有无针对供者,或者供者针对受者的HLA抗体,在器官移植前一定要进行CDC检测。如果受者血清中检出针对供者的HLA抗体,一般认为是配合禁忌,移植后受者会发生超急性排异反应,导致移植失败。由于试验是在施行器官移植术前临时进行匹配的试验,要求在短时间内报告结果,因此我们对该技术作了改良并与传统 方法 进行比较,收到满意效果。现报告如下:
一、材料和方法
1.被检对象: 标本来源于我院近10个月住院和门诊280例拟做肾移植待诊病人和其他器官移植待诊病人,采静脉血2 ml不抗凝待测。
2.试剂: 免疫磁珠、荧光染液由美国O L公司提供,抗全淋巴细胞抗体试剂购自武汉生物制品 研究 所。
3.方法:(1)改良一步法:采用免疫磁珠3~5 μl分离出淋巴细胞,在Terasaki板上每孔加入无菌矿物油5 μl,每排第1孔加生理盐水1 μl做阴性对照,第2孔加抗全淋巴细胞抗体1 μl做阳性对照,第3~6孔各加受者血清1 μl(即重复4孔试验),每孔各加供者淋巴细胞1 μl(细胞浓度为2 000个/μl),每孔各加补体1 μl,置22~25室温下反应45 min左右,每孔加荧光染液5 μl,倒置荧光显微镜下观察细胞毒性反应, 分析 判断结果。(2)传统常规法见 参考 文献 [1]。
二、结果
采用改良一步法进行了400次淋巴细胞毒交叉试验,有9次检出阳性(阳性率为2.25%)。其中1例患者反复多次CDC阳性,后进行HLA抗体检测, 特定细胞群反应抗体 (Panel Reactive Antibody, PRA) 阳性率为53.5%, 提示抗HLA-A2抗体增多,故放弃移植。
一步法与传统法试验比较:样本用量一步法1 μl,传统法40 μl;试验全过程一步法1.5 h内完成,传统法需2.5~4 h;补体用量一步法1 μl,传统法40 μl;30例标本用双盲法同时试验,结果一致。
三、讨论
改良一步法CDC缩短和简化了试验时间、操作步骤,整个试验过程在1.5 h内完成。大量标本还可同时输入 计算 机分析。免疫磁珠分离淋巴细胞纯度高且时间短,用荧光染色的结果容易观察,倒置荧光显微镜下死细胞呈红色,活细胞呈绿色,对比分明,易于识别。而传统常规法的伊红染色,在镜下观察判断细胞死活结果有很大的难度,经30例样本用2种方法进行双盲试验,其结果一致,可以证明改良法在样本用量上、淋巴细胞分离、交叉反应时间及判断结果上均表现出优于传统法的特点。同时改良法可节省抗全淋巴细胞抗体、补体等试剂用量,降低试验成本。
参考文献
1,赵桐茂. HLA原理及其 应用 . 上海 科学 技术出版社,1984. 278-279.
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