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生物化学实验（甲）自主实验（微型研究课题）设计与实践 不同种类蔬菜SOD提取和活性比较 花亦洁3080005006 一、实验背景和目的 　 超氧化物歧化酶Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充 SOD具有抗衰老的特殊效果1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。 生物体在长期的生命活动中,总会由于环境因素或生理条件的变化而出现氧自由基增加，抗氧化能力下降的情况，并由此引发一些疾病，如脂质过氧化与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、辐射损伤、高度中毒等有关。SOD作为生物体内一种重要的抗氧化剂，起着非常重要的作用。同时，SOD还可以作为一种添加剂，添加到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由基增多而引起的一系列疾病方面起到一定作用。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成，由此可见SOD的重要性。超氧化物歧化酶（E1.15.1.1）（Superoxide Dismutase, SOD）是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的金属酶。它催化超氧化物阴离子自由基（O2-）发生歧化反应，从而消除自由基： ?SOD+O2?→ Mn+?SOD+O2 Mn+?SOD+O2?+2H+→M(n+1)+?SOD+H2O2. 其中 M =Cu(n=1)、Mn(n=2)、Fe (n=2)、Ni (n=2). SOD在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起着重要作用。 邻苯三酚自氧化 主要反应如下： 酶活性单位采用抑制邻苯三酚光化还原50%为一个酶活性单位表示： 三、实验器材与仪器 试管15cm; 精确pH试纸; 研钵; 纱布; 漏斗; 玻棒; 量筒； 容量瓶； 移液管（5ml）； 移液枪（1000μl） Beckman Coulter的Avanti? Centrifuge J-25; 50mL离心管 北京普新通用仪器有限责任公司产的TU-1800紫外可见光光度计 60℃、25℃水浴锅 四、实验材料与试剂 实验材料：新鲜莴苣、红果番茄、芹菜、韭黄 实验试剂： 1、0.05mol/L pH7.8 2、0.1mol/L Tris-HCl (pH8.2内含 2mmol/L EDTA) 3、60 mmol/L邻苯三酚 4、石英砂 5、氯仿 6、乙醇 7、二次蒸馏水 五、实验操作方法和步骤 试剂的配制： 1、0.05mol/L pH7.8磷酸缓冲液 （1）0.2mol/L的 Na2HPO4；称取NaH2PO4.2H2O 固体0.78g用重蒸水定容至25ml。 （2）0.2mol/L的 Na2HPO4：称取Na2HPO4.12H2O 固体1.7908g用重蒸水定容至25ml。 （3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取5.9ml 0.2mol/L的 NaH2PO4溶液和25ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O溶液,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5）。（理论比为19：81）。 取2.5ml上述溶液于100ml容量瓶定容得0.05mol/L磷酸缓冲液用一定浓度NaOH溶液调节pH至7.8即得。 2、0.1mol/L Tris-HCl (pH8.2内含 2mmol/L EDTA) Tris（分 子 式: NH2C(CH2OH)3 、分 子 量: 121.14）EDTA(分子量：292.248、分子式：C10H16N2O8) 称取0.303g Tris，25ml容量瓶定容，称取0.015g的EDTA溶于上述溶液，用约4mol/L的HCl调PH即可。 3、60 mmol/L邻苯三酚（分子式 C6H6O3、分子量 126.11）： 称取0.189165g邻苯三酚，25ml容量瓶定容即可。 4.氯仿-乙醇混合液： 将氯仿和无水乙醇以3：5体积比混合。 验操作步骤 1、SOD的提取 取3g新鲜蔬菜食用部分，1：5（W/V）加入0.05mol/L pH7.8 磷酸缓冲液，加石英砂少许，冰浴中研磨成匀浆，二层纱布过滤液，于4℃，1300r/min离心20min，上清液为SOD粗提取液。 2、SOD的纯化 （1）热处理：SOD粗提取液于60℃热