第一章 细胞生物学实验-免疫荧光观察细胞骨架.pdf

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细胞骨架的免疫荧光标记及定位观察 免疫荧光技术 免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术,是标记免疫 技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来 的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗 原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进 行标记并获得成功。 根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再 用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。荧光素在一定条件下可与 抗体分子结合同时不影响抗体免疫活性的特性。用荧光抗体浸染可能含抗原的细胞 或组织切片,如有相应抗原存在,则抗原与标记抗体特异性结合,形成的免疫复合 物固定于细胞上,不易洗脱,在荧光显微镜下可以观察到发出荧光的可见物体,从 而可以对抗原或抗体的性质进行定性、定量和定位分析。常用的荧光素有异硫氰酸 荧光素(FITC)和罗丹明(Rhodamine)等。 免疫荧光的应用范围极其广泛,可以用于内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、 神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活 性物质的研究。 免疫荧光技术的主要特点是:特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是:存 在非特异性染色,结果判定的客观性不足,步骤比较复杂。 免疫荧光技术 免疫荧光分为直接法、间接法和补体结合法。 直接法:将荧光素直接偶联在一抗上,不需要二抗。 1.检查抗原法:这是最早的方法,用已知特异性抗体与荧光素结合,制成 荧光特异性抗体,直接与细胞或组织中相应抗原结合,在荧光显微镜下即 可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便,但一种荧光抗体 只能检查一种抗原,敏感性较差。 2.检查抗体法:将抗原标记上荧光素,即为荧光抗原,用此荧光抗原与细 胞或组织内相应抗体反应,而将抗体定位检测出来。 免疫荧光技术 间接法:先用未标记的特异抗体(一抗)与抗原结合,再用有荧光素标记的抗抗体 (二抗,如抗IgG 的抗体)与标本反应,样品中若有与一抗结合的抗原存在,则会 形成抗原-抗体-抗抗体复合物从而达到染色的目的。 1.检查抗体法:此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应,再用此抗原的特 异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合,因为抗原夹在细胞抗体与荧光 抗体之间,故称夹心法。 2.检查抗体法:在样品中加上待检血清,如果血清含有样品中某种抗原的抗体,抗 体便沉淀结合在抗原上,再用间接荧光抗体(如抗种属特异性的IgG 荧光抗体)与 结合在抗原上的抗体反应,在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异 性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。 3.检查抗原法:先用特异性抗体(一抗)与样品反应,再用PBS 洗去未与抗原结合 的抗体,再用间接荧光抗体(二抗)与结合在抗原上的抗体(二抗的抗原)结合, 形成抗原-抗体- 荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著 多于直接法,从而提高了灵敏度。这是现在最广泛应用的技术。 免疫荧光技术 补体结合法:又称抗补体染色法,是间接染色法的一种改良,基于补体结 合反应的原理,通过荧光标记抗补体的抗体,用于鉴定未知抗原或未知抗 体(待检测的血清)。 1. 直接检查组织内免疫复合物法:用抗补体的荧光抗体直接作用于组织 切片,荧光抗体可以和结合在抗原抗体复合物上的补体反应,形成抗 原抗体补体复合物-抗补体荧光抗体复合物,在荧光显微镜下呈现阳 性荧光的部位就是免疫复合物的存在处,此法常用于肾穿刺组织活检 诊断等。 2. 间接检查组织内抗原法:常将新鲜补体与一抗混合后同时加在组织切 片上37℃孵育,如发生抗原补体抗体反应,补体就结合在此复合物上, 再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应,形成抗原-抗体-抗补体荧 光抗体的复合物,此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种 属来源的一抗的标记显示。 免疫荧光中的抗原和抗体 高特异性的抗体是免疫荧光实验的关键,但是很多的实际研究没有商品化的抗 体,就需要制备免疫血清和纯化免疫球蛋白,需要注意的是: 1. 在抗体制备过程中,用于免疫的抗原必

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