实验三酵母RNA的提制(浓盐法).doc

实验三 酵母RNA的提制（浓盐法） 一、目的 学习和掌握从酵母中提制RNA的原理和方法，以加深对核酸性质的认识。 二、原理 酵母含 RNA 2.67％～10.0％，DNA很少（0.03％～0.516％），而且菌体容易收集，RNA也易于分离，所以选用酵母为实验材料。 RNA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去。再根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，将pH调至2.0～2.5，使RNA沉淀，进行离心收集。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者利用稀碱溶解细胞壁，使RNA释放出来，这种方法提取时间短，但RNA在此条件下不稳定，容易分解；后者在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的透性，使RNA释放出来，此法易掌握，产品颜色较好。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）量筒（50ml） （2）三角瓶（100ml） （3）烧杯（250ml，50ml，10ml） （4）布氏漏斗（40mm） （5）吸滤瓶（125ml） （6）表面皿（6cm） （7）751型分光光度计 （8）离心机（4000r／min） （9）恒温水浴 （10）药物天平 （11）烘箱 2．试剂 （l）NaCl（化学纯） （2）6mol／L HCI （3）95％乙醇（化学纯） 3．材料 鲜酵母或干酵母；pHO.5～5.0的精密试纸。 四、操作步骤 1．提取 称取鲜酵母 159或干酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，搅拌均匀，置于沸水浴中提取lh。 2．分离 将上述提取液用自来水冷却后，装入大离心管内，以4000r／min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。 3．沉淀RNA 将离心得到的上清液倾于50ml烧杯内，并置入放有冰块的250ml烧杯中冷却．待冷至10℃以下时，用6mol／L HCI 小心地调节pH值至2.0～2.5（注意严格控制pH）。调好后继续于冰水中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。 4．洗涤和抽滤 上述悬浮液以 4000r／min离心 10min，得到 RNA沉淀。将沉淀物放在 10ml小烧杯内，用95％的乙醇 5～10ml充分搅拌洗涤，然后在布氏漏斗上用射水泵抽气过滤，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。 5．干燥 从布氏漏斗上取下沉淀物，放在6cm表面皿上，铺成薄层，置于80℃烘箱内干燥。将干燥后的RNA制品称重，存放于干燥器内。 6．含量测定 将干燥后RNA产品配制成浓度为 10—50pg／ml的溶液，在751型分光光度 计上测定其260nm处的吸光度，按下式计算RNA含量： 式中，A260为260nm处的吸光度；L为比色杯光径（cm）；0.024为lml溶液含lμg RNA的吸光度。 五、结果处理 根据含量测定的结果按下式计算提取率 六、注意事项 1．用浓盐法提取RNA时应注意掌握温度，避免在20～27℃之间停留时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。 2．加热至90～100℃使蛋白质变性，破坏两类磷酸酯酶，有利于RNA的提取。 七、思考题 1．沉淀RNA之前为什么要冷却上清液至10℃以下？ 2．为什么要将pH调至2.0～2.5？ 参考文献 文树基。主编基础生物化学实验指导．西安：陕西科学技术出版社，1994 西北农业大学主编基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1986 袁玉苏，朱婉华，陈钧辉编生物化学实验北京：人民教育出版社，1979 朱检，曹凯鸣，周M庞，蔡武城，袁厚积编著．生物化学实验上海：上海科学技术出版社，1981