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农业微生物学实验课 生命科学学院 侯春实 验 四微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏 目的要求 1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态特征，并加以区分。 2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，并接种于斜面，进一步加强无菌操作技术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见方法。 实验内容 微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、霉菌、酵母菌——放在后面介绍） 平板菌落计数（细菌、放线菌、霉菌） 挑取单菌落接种于斜面 介绍菌种保藏的原理和方法 对于一个样品，针对微生物来说最想了解的问题（首要问题） 存在的微生物种类 各类微生物的数量 各类微生物的作用 说明： 只是针对可人工培养的微生物来说，乐观估计可人工培养的部分只占总数的10%（保守估计只有1%）； 证据来源有两方面——分子生物学的探索；和原位培养的比较。 实 验 内 容 一——微生物菌落形态观察及区分 一、微生物的形态和菌落特征的比较表 二、细菌菌落形态的多样性（示意图） 延展性较强的一些霉菌菌丝（松散） 平板中菌落形态 三、菌落特征描写方法 ①　大小 大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。 ② 颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。 ③ 干湿情况 干燥、湿润、粘稠 ④ 形态 圆形、不规则等 ⑤ 高度 扁平、隆起、凹下 ⑥ 透明程度 透明、半透明、不透明 ⑦ 边缘 整齐、不整齐 注意：可以进一步细分描述 菌落形态可因培养基成分不同而发生显著变化（枯草芽孢杆菌在营养缺乏时形成的雪花状菌落） 四、各类型菌落的总体特征 细菌——含水量高（多），湿润，细腻（个体小） 细菌菌落说明：光滑型——一般具有荚膜；表面粗糙、褶皱、折光性强（不透明）菌落——一般具有芽孢；菌落大而扁平——一般具有鞭毛。 放线菌——菌落大小差别不大，相对较小，干燥（粉状），菌丝细（肉眼分不清楚）。 霉菌——菌落较大，干燥（粉状，较粗，颗粒），丝状较粗（肉眼可以区分）。 以最少的特征指标完成区分或分类最好。 细菌的培养特征 细菌菌落扫描电镜显微照片 实 验 内 容 二——从分离平板上挑取单菌落 挑取细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（接种环） 挑取放线菌单菌落接种于高氏1号培养基斜面上（接种环、接种钩） 挑取霉菌单菌落接种于马丁氏培养基斜面上（接种环、接种钩） 一般流程图（无菌操作）： 拿起平板并打开→用接种工具挑取单菌落→放于酒精灯外焰旁（不得过近？）→放下平板拿起斜面并取下塞子→用已粘有菌体的接种工具在斜面上划“之”字线或直线→接种工具取出、灼烧→塞好胶塞→作标记（菌种名称、接种人、接种日期等）。 接种斜面的演示图 接种斜面的演示图 说明： 注意试管斜面的拿法（手掌向上，斜面向上），与接种工具的配合使用； 记号笔标记时，过火烤一下，字不容易掉； 挑取单菌落于相应斜面，管口标记学号，橡皮筋捆扎（三支）； 三支斜面的接种情况作为一次考核，记入平时成绩。 实 验 内 容 三——平板菌落计数 一、相关知识介绍 1、微生物增殖和样品微生物数量的计量平板菌落计数 使单细胞形成菌落，一个单菌落代表一个单细胞，从而反映出微生物的数量。 （1）利用计数器在显微镜下直接计数（以后介绍）； （2）最大或然数（Most probable number，MPN，又称稀释培养测数法、最大可能数）； 适用具有特殊生理功能的类群——存在但不能人工培养形成单菌落，可以利用生化手段检测出；利用统计学原理计算，结果粗放，只能得到数量级（近似数）。 （3）菌体浊度的测定（只针对单细胞微生物）； 利用分光光度计在600nm测定吸光度值。 （4）细胞干重和湿重的测定（有时湿重以体积计量）； （5）各种细胞物质含量的测定（蛋白质、核酸、 ATP、磷、叶绿素等定量测定）——建立了多种快速检测方法； 说明：后两种对丝状菌比较有意义。 2、常见微生物检测项目 （1）常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数 （2）致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O-157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等 3、快速检测方法的现状 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向（？）。 4、常规微生物快速检测技术现状 传统计数改良法： （1）