酵母单杂交手册(translated by mony).pdf

酵母单杂交手册 目录 1 简介 2 试剂盒包含的内容 3 缩写 4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息 5 附加材料酵母培养基 A cDNA 扩增、文库构建和筛选所需的附加材料 B 相应的培养基要求 6 诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建 A 方法：合成、克隆p 目的基因-AbAi 质粒 B 方法：构建诱饵-受体酵母菌株 7 利用AbAr 的表达检测诱饵菌株 A 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA 浓度 8 cDNA 文库的构建 A 方法：利用SMART 技术合成cDNA 第一链 B 方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA 第一链 C 方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns 技术纯化合成的双链DNA 9 单杂交的文库的构建和筛选 A 方法：单杂交cDNA 的文库的构建和筛选 10 结果分析 11 阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离 A 方法：通过划板确认受体表型 B 方法：酵母菌落PCR 以消除Duplicate Clones （假阳性克隆？多拷贝？） C 分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒 D 方法：区分阳性克隆和假阳性克隆 E 分析阳性克隆的序列 12 问题排除指南 13 参考文献 附录A ：质粒信息 附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物 附录C ：SMART 技术原理 图表 图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System 筛选蛋白-DNA 的相互作用 图2 将相应的片段整合到Y1HGold 菌株，构建诱饵受体菌株 图3 利用SMART 技术和酵母的特点构建和筛选你的文库 图4 通过菌落PCR 确认pBait-AbAi 构建成功 图5 利用SMART 技术合成cDNA 第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART 技术进行扩增 图7 利用CHROMA SPIN+TE-400 技术并收集产物 图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异 图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用 图10 pAbAi 载体和做对照的p53-AbAi 载体图谱 图11 pGADT7-Rec 载体图谱 图12 pGADT7 载体图谱 表格 表1 Y1HGold 酵母菌株基因型 表2 利用各种SD 培养基验证Y1HGold 酵母菌株的表型 r 表3 AbA 本底表达的预期结果 表4 RNA 总量与最佳循环数直接的关系 表5 Matchmaker Gold One-Hybrid 问题排除指南 表6 Set 1 酵母培养基和Set 1 Plus 酵母培养基的组分 表7 Matchmaker Gold Protocols 所包含的每一个内容 1 简介 A 介绍 Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 为建立酵母单杂交cDNA 文库的建 立提供了一个简单高效的方法。Matchmaker Gold Systems 具有AbA 抗性因而具有很强的筛 选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析 蛋白质与DNA 之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1） 图1. 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System 筛选蛋白-DNA 的相互作用 将一至三个目的DNA 重复序列克隆至pAbAi 报告载体，然后整合到Y1HGold 酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告 菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA 抗性 (AbAr) 基因的表达。 酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种 方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli 内构建的文库。Matchmaker Gold System 方法中的文库构建用到了SMART cDNA 合成技术，只需从任意组织部位提取总量为 100ng 的RNA，即可使用该方法构建cDNA 文库。 B 酵母单杂交的原理——蛋白-DNA 互作的一种实验方法 诱饵（Bait）——DNA 目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi 载体上，构建好的pBait-AbAi 载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold 酵