互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌分子鉴定与`防治技术.doc

互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌分子鉴定及防治技术 　　摘 要：为明确青海互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌的分类，随机调查种植黄瓜的日光温室，采集发病的植株组织，对白粉菌进行无性型扫描电镜观察和DNA提取。试验结果发现，互助县温室大棚内白粉菌为苍耳单囊白粉菌，生产中仍以化学防治为主，可结合高温闷棚灭菌 关键词：黄瓜白粉病;分子鉴定;电镜扫描;防治技术 青海互助县位于青藏高原地区，海拔较高、降雨量少、昼夜温差大、日照时间长、气候冷凉[1]。由于近年来青海省城市化进程加快，日光温室大面积兴起，温室蔬菜的生产发展非常快，其中黄瓜因产量较高、采收期短、经济效益好，被菜农广泛种植。白粉病是黄瓜上常发生的一种病害，也是一种世界性病害，一般在黄瓜生长后期发生严重，严重影响黄瓜的生物学产量及质量。目前关于瓜类白粉菌的分类一直存在争议，为明确黄瓜白粉菌的分类地位，为互助县黄瓜白粉病的防治及更深入的研究提供材料，对互助县温室大棚黄瓜白粉病病原菌进行分子鉴定 1 材料与方法 1.1 黄瓜白粉菌标本的采集 对互助县种植黄瓜的日光温室进行随机调查，观察白粉菌在黄瓜植株上寄生的形态，并对白粉菌进行采集 1.2 黄瓜白粉菌分子鉴定方法 ①白粉菌无性型扫描电镜观察 根据Cook等 [2]的研究，对黄瓜白粉菌无性型进行固定，然后扫描电镜观察其分生孢子梗和分生孢子特征，以便进行分子鉴定 a.固定。将被白粉菌侵染的植株组织切成小块（4 mm×4 mm）放入盛有戊二醛 （浓度4%，pH值6.8）固定液的小瓶中，贴上标签，注明采集信息 b.抽气。将上一步装样的小瓶置于真空干燥仪中抽干空气，至叶片组织完全沉到小瓶底部 c.制样 （漂洗、脱水和干燥）。首先用pH值6.8、0.1 moL/L的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，共进行3次，每次20 min;然后用30%、50%、70%、90%、100%酒精进行梯度脱水，每次20 min，其中100%酒精中脱水2次;最后用100%的乙酸异戊酯置换2次，每次 20 min 将制备好的白粉菌无性型样品送至西北农林科技大学扫描电镜观察室观察、摄像 ②黄瓜白粉菌基因组DNA提取。a.将菌丝体刮下置于1.5 mL离心管，充分研磨，加600 μL CTAB提取液混匀，于60～65℃水浴中温育1～2 h b.加入等体积（600 μL）的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）振荡器离心管混匀，离心10 min （12 000 r/min） c.取上清液置于新离心管中，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）于振荡器混匀，然后离心10 min （12 000 r/min） d.取上清液，加入2倍体积的CTAB沉淀液，混匀，室温孵育20～30 min，室温离心15 min（12 000 r/min） f.弃上清液，加350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液（即DNA溶解液）溶解沉淀，然后加入350 μL氯仿，混匀30 s g.离心10 min（12 000 r/min），分层，将上清液移至一新的离心管中，加入0.6～0.8体积的异丙醇，混匀，室温静置40 min h.室温离心20 min（12 000 r/min），向沉淀加入500 μL，70%乙醇，混匀 i.离心5 min（12 000 r/min），小心仔细倒入上清液，弃之 j.重复步骤i，室温干燥后，将DNA溶于40 μL去离子无菌水中，于4℃保存备用 ③PCR扩增 PCR扩增引物参考White等[3]的方法，送上海生物工程有限公司合成 a.rDNA-ITS PCR引物序列。ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ b.PCR扩增体系。见表1 c.PCR反应程序。95℃预变性4 min，94℃变性1 min，54～60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环;72℃再延伸8 min;4℃保存 ④测序分析 将PCR产物送至上海生工公司进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST同源性对比，找出最相似的序列。利用软件Mega 4.0构建系统发育树，并对序列结构及序列间亲缘关系进行分析 2 结果与分析 2.1 为害症状 白粉病主要为害黄瓜的叶片、叶柄及茎，一般不为害果实，成株及幼苗均可染病。发病叶片正面或背面产生白色近圆形的小粉斑，即稀疏的菌丝，然后菌丝不断生长，病部变黄，粉斑逐渐扩大成边缘不明显的大片白粉区，布满叶面，叶面褪绿、枯黄变脆，直至整个叶片枯死。茎部受害症状与叶片相似。粉层严重会影响光合作用，使植株正常新陈代谢受到干扰，造成早衰，产