掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯―D抗炎与抗过敏作用探讨.docVIP

掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯―D的抗炎和抗过敏作用研究 　　摘 要：本文旨在研究掌叶蜂斗菜提物取物对过敏反应及炎症的影响， 为其临床治疗过敏性哮喘提供药理学依据。主要通过硅胶柱色谱技术从掌叶蜂斗菜叶片中得到蜂斗菜内酯-D；采用抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒模型，测定蜂斗菜内酯-D对β-HEX的影响；通过 OVA 诱导和激发 BALB/c 小鼠，构建哮喘小鼠模型，并对支气管灌洗液（BALF）中炎症细胞计数和分类计数，观察蜂斗菜内酯-D的抗过敏、抗炎作用。结果表明0.1-10ug/ml蜂斗菜内酯-D对β-HEX抑制率分别为 26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，可见蜂斗菜内酯-D在此剂量内能够较明显抑制抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放，抑制率与浓度相关；通过分析BALF中炎症细胞的数量， 蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比，能有效抑制BALF中炎症细胞的数量（P95% 1.2.3 蜂斗菜内酯-D对抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒 β-HEX 释放的影响 实验分组：正常组、模型组、给药组、药物阴性对照组、富马酸酮替芬阳性对照组。 其中，给药组和药物阴性对照组分别由蜂斗菜内酯-D 0.1、1、10、100ug/ml 四个浓度组成；富马酸酮替芬 100ug/ml作为阳性对照药组。将处于对数生长期的 RBL-2H3 细胞从培养箱中取出，进行细胞消化并制备成细胞悬液。用培养基调整细胞数至 2.5×105 /mL，每孔 1000μL 接种于 24 孔培养板中，在37℃ 5% CO2培养箱中培养。按已定方法分组后，每孔加入 0.25?g/mL 的抗DNP-lgE 单抗致敏孵育过夜。次日，各浓度的药物加至给药组及药物阴性对照组中预孵育1h，用等量RIPM1640培养基替代加至正常组、模型组。1h后，用PIPES缓冲液清洗细胞 3 次。每孔加入 200μL PIPES缓冲液（含25ng/mL 的 DNP-HSA）至模型组及给药组，用等量缓冲液替代加至正常组和药物阴性对照组，37℃孵育1 h，刺激细胞 β-HEX 的释放。每组上清各取 50μL，加入到 96 孔培养板中，取50μL显色液加入，37℃孵育 1h。加入 200μL 碳酸钠缓冲液终止反应，在405nm 波长下检测 OD 值。β-HEX 释放抑制率计算：β-HEX 抑制率（%）=[1-（TOD-BOD-NOD）/（COD-NOD）] ×100%。 　　1.2.4 支气管哮喘小鼠模型的建立及BALF中炎症细胞计数和分类计数 雌性，4～6周龄，Balb/c小鼠， 18只 ，随机分为阴性对照组、药物对照组、OVA模型组和药物治疗组。始终给予PBS液处理阴性对照组，在第0，1，2天， 给予阴性对照组和药物对照组小鼠腹腔注射PBS 0.2ml/只，给予OVA模型组和药物治疗组小鼠腹腔注射100ug OVA+ 2mgAl（OH）3，在第5～11d，给予阴性对照组和OVA模型组小鼠每只每天腹腔注射0.2ml PBS液，药物对照组和药物治疗组腹腔注射蜂斗菜内酯-D（1mg/kg PBS溶解），在第14、15、19d，乙醚麻醉小鼠后， OVA滴鼻激发，最后一次滴鼻后48小时处死小鼠，取血，支气管肺泡灌洗（BALF），回收支气管肺泡灌洗液，记录回吸收量；取BALF 500g，37℃，离心5min，取离心后的沉淀细胞，用1mL PBS重悬细胞，进行计数；细胞悬液涂片，染色液染色，计数200个细胞，进行细胞分类计数 2 实验结果 2.1 蜂斗菜内酯-D鉴定 化合物白色针状结晶，经EI-MS（m/z）、IR（KBr，cm-1）、1HNMR（500MHz，CDCL3） 、13CNMR和DEPT数据分析，比较文献[7] ，确认化合物为蜂斗菜内酯-D（Bakkenolide-D） 2.2 蜂斗菜内酯-D对抗原诱导 RBL-2H3 细胞活化脱颗粒 β-HEX 释放的影响 根据相应的β-HEX释放抑制率的公式计算所得0.1～100ug/L蜂斗菜内酯-D的抑制率分别为26.82%、34.1%、44.25%、61.32%。这表明该剂量范围内的蜂斗菜内酯-D对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放具有较明显的抑制作用，抑制作用强弱与浓度相关，如图1。其中阳性对照药富马酸酮替芬β-HEX释放抑制率为63.0%。结果显示100ug /ml的蜂斗菜内酯对β-HEX释放的抑制作用很明显，可与阳性药物富马酸酮替芬的抑制作用相媲美 图1 蜂斗菜内酯-D（0.1-100ug/ml）对抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱粒β-HEX释放的影响结果以均值±SD表示（n=3）。实验重复3次 2.3 蜂斗菜内酯-D对过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌