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聚乙二醇修饰在蛋白药物领域的研究进展 摘要: 随着科学家对蛋白质工程技术的深入研究，聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一，得到越来越广泛的应用。鉴于聚乙二醇本身的特性与蛋白质结构的复杂性，如何使它更好的修饰蛋白并对其修饰位点进行分析鉴定成为科学研究的重点与难点。本文主要简述就PEG定点修饰的技术和PEG修饰位点的分析检测方法，并展望了PEG修饰技术未来的发展趋势。 关键词：聚乙二醇；蛋白质药物；结构；蛋白质工程；修饰位点 蛋白质药物的聚乙二醇修饰简介 药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上是一种蛋白质工程分子修饰方法。药物的聚乙二醇修饰可分为两个阶段。 第一阶段的修饰技术局限于应用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇(20000)。但第一代聚乙二醇修饰药物通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。以应用相对分子质量高(20000)聚乙二醇修饰剂为特征的第二阶段的修饰技术具有连接稳定、定点修饰、控释等特点,修饰后的药物具有更高的生物活性、更好的物理及热稳定性、更高的产品均一性和纯度。 1.1 修饰氨基 多肽蛋白质分子参与PEG化反应的基团常为α-和ε-氨基,因此用于修饰氨基的单甲氧基聚乙二醇衍生物(mPEGs)种类较多,可分为烷基化mPEGs和酰基化mPEGs两大类。烷基化mPEGs,包括mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸及mPEG-环氧化物等。其中mPEG-醛的修饰条件温和,交联时不引入其他活性基团,在低pH下仅修饰N-末端氨基,对活性影响较小,同时方便产物的纯化和鉴定,已用于G-CSF、IFN及CD4-IgG等的修饰。mPEG-三氟乙磺酸的修饰条件也较温和,对GM-CSF修饰后使其保持较好活性。mPEG-环氧化物虽制备简单,但偶联物含活性羟基,易发生其他交联反应,修饰率也较低。酰基化mPEGs,包括mPEG-琥珀酰亚胺酯和mPEG-苯并三唑碳酸酯,这两种修饰剂可优先与赖氨酸残基反应,也可与组氨酸和酪氨酸残基反应。此外,mPEG-硝基苯碳酸酯、mPEG-三氯苯碳酸酯及mPEG-氧羰基咪唑比前述两种反应活性低,但修饰专一性较好。 1.2修饰羧基 有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。一般选用mPEG-酰肼或mPEG-胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。mPEG-酰肼是近年来开发的又一种可与羧基特异性结合的修饰剂。 1.3修饰巯基 与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性。 目前可用于巯基修饰的mPEGs包括mPEG-马来酰亚胺、mPEG-邻吡啶-二硫醚、mPEG-乙烯基砜及mPEG-碘乙酰胺等。其中mPEG-马来酰亚胺制备简单,应用较多。PEG-邻吡啶-二硫醚与蛋白质偶联形成的S—S键,在生理条件下可缓慢水解,释放出天然蛋白质,有利于活性的恢复,但修饰率低。PEG-乙烯基砜在pH7-9范围内可选择性的与巯基反应,当pH较高时则与氨基交联。PEG-碘乙酰胺的优势在于经强酸水解后,可释放出半胱氨酸衍生物,易于鉴定。 聚乙二醇修饰技术的前景展望 自从20世纪70年代以来,已有十余种PEG修饰的蛋白药物上市,，表现出优良的临床效果，还有PEG-水蛭素等多种药物正处于临床实验阶段针。但仍有许多蛋白药物由于常规的多点修饰不能得到理想的效果,因此随着PEG修饰蛋白技术研究的不断深入,已从原来的多点随机修饰向定点单修饰发展,由复杂的多单元操作向便捷高效的集成操作发展,提高了修饰蛋白的生物活性,降低了PEG修饰的成本,扩大了PEG修饰技术的应用范围。鉴于蛋白质类药物本省的理化特性,只有根据其不同性质综合考虑，选择合适的PEG修饰技术才能起到良好的效果。 参考文献 [1]董惠钧,姜俊云,郑立军.庞俊星蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展中国生化药物杂志[J].2009,30(3):199-202. [2]秦海娜,修志龙.聚乙二醇修饰蛋白质的活化与检测方法.化学通报[J].2003,66:1-10 [3]张修建,王清明,陈惠鹏.药物的聚乙二醇修饰研究进展.解放军药学学报[ J ]. 2003,19(3):213-216. [4]胡远东等胡远东,白坚石,焦克芳,等.PEG修饰牛血红蛋白的计算机模拟研究.生物物