真核生物组织细胞基因组DNA的提取及含量和纯度测定.docxVIP

《分子生物学实验》实验报告实验名称：真核生物组织细胞基因组DNA的提取及含量和纯度测定姓名：陈杰学号： 3140104666序号：25同组同学：唐晨曦带教教师：刘伟俞萍实验日期： 2015年10月13日目录1.原理21.1真核生物基因组DNA的提取和含量测定21.2 二苯胺显色法测定DNA含量31.3 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度42.操作步骤42.1真核生物基因组DNA的提取和含量测定42.1.1 组织细胞的裂解42.1.2 裂解物中蛋白质的去除42.1.3 DNA的沉淀52.2 二苯胺显色法测定DNA含量52.2.1 DNA标准曲线的制作52.2.2 样品的测定52.2.3 DNA含量的计算52.3紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度53.实验结果63.1 照片记录63.2数据处理63.2.1 二苯胺显色法测定DNA含量63.2.2紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度74.讨论71.原理1.1真核生物基因组DNA的提取和含量测定制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作。本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。DNA在0.14mol/L NaCl中不溶解,而RNA可溶解。用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K和SDS）,蛋白酶K为温和的方法破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性，EDTA可以变性Dnase，SDS还可以去除部分的蛋白，使核蛋白体从DNA上解离。然后加RNase以去除RNA，再用苯酚-氯仿抽提法反复抽提提取DNA。苯酚-氯仿抽提法：酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚的比重为1.07，因此在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开，甚至当从溶质浓度较高的水相中抽提蛋白时会发生两相颠倒的情况。若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。变性蛋白一般集中在两相之间的界面层；而脂类则有效地分配在有机相中；核酸则被留于上层水相。该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次，费时，所得到的核酸仍有部分溶解。砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase的活性。1.2二苯胺显色法测定DNA含量DNA在酸性条件下加热，酸解释出脱氧核糖。脱氧核糖在酸性环境中脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595 nm处有最大吸收。DNA在40~400ug范围内，光吸收值与DNA的含量成正比。在反应液中加入少量乙醇，可以提高反应灵敏度。除脱氧核糖外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应。其他多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。脱氧核糖与二苯胺反应过程可表示如下：1.3 紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度1．紫外分光光度法测定核酸含量：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。2．紫外分光光度法测定DNA纯度：由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。2.操作步骤2.1真核生物基因组DNA的提取和含量测定2.1.1 组织细胞的裂解 1、切取0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗3次。当组织离开机体，DNA酶就会表现出活性。在冰冷的生理盐水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因组DNA被降解。2、碎鼠肝转入玻璃匀浆器中，加入2mL分离缓冲液，匀浆（冰上操作）。3、匀浆液1.6mL转入离心管，4℃ , 5000rpm离心5min；沉淀加0.4mL无菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100μg/ml的蛋白酶K），慢慢颠倒混匀，50℃保温90分钟, 直到组织完全解体。4、加10mg/ml的RNase 16μl (终浓度200μg/ml)，37℃保温40min。2.1.2裂解物中蛋白质的去除1、加等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，慢慢颠倒混匀，冰上静置5min。待分层后, 于4℃，13000rpm离心10min。离心后可见分层，上层为水相含DNA，下层为有机溶剂层，变性蛋白质介于两层之间。2、小心吸出上面的水层并转移到新的小离心管中，根据吸出的量再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，