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淋巴细胞分层液有两种（1）聚蔗糖—泛影葡胺液：聚蔗糖（polysucrose solution）,商品名Ficoll，分子量400 000，多配制成40±1％（W/V）水溶液，也有干粉出售。应用时，用蒸馏水配制9％溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici)，商品名Vrografin，结构式为3，5—二乙酰氨基2，4，6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60％或75％，每安瓶为20ml装，常用于人的脏器造影。应用时，取60％泛影葡胺原液20ml，加双蒸馏水15.38ml，即为33.9％泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制：?9％聚蔗糖液 24份33.9％泛影葡胺液 10份混合即可。必要时，可测比重。需要备用，可用G5漏斗过滤除菌或114.3高压灭菌15min，4保存。一般可保存3个月。（2）泛影葡胺—右旋糖酐（dextran）液34％泛影葡胺液 10份60％右旋糖酐液 12.5份混合，即为比重1.07～1.09的分层液。分装于棕色瓶中，4冰箱保存备用。 人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，根据不同试验有相对纯度，尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。本文介绍常用的密度梯度离心法的原理及方法。 人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.074±0.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 常用的分层液有Ficoll，Ficoll是一种合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集，常使用60g/L低浓度溶液（密度1.020）加入泛影葡胺（Hypague），应用浓度为340g/L（密度1.200），以泛影葡胺适当比例与Ficoll混合，可配制成比重合适的细胞分层液（密度1.077±0.001）。称为Ficoll-Hypague分层液或称淋巴细胞分离液。 【材料】 1、抗凝管。 2、淋巴细胞分离液(有商品供应，比重1.077±0.001）。 3、无Ca++、Mg++、Hanks 液（D-Hankls ）。 4、刻度吸管、毛细吸管、离心管、离心机等。 【方法】 1、采静脉血2ml加入抗凝管，轻轻摇动试管，混匀，5min后加入Hanks 液2ml，手动轻轻摇匀。 2、将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml淋巴细胞分离液管的液面上，注意保持两种液体界面清晰。 3、将试管平衡后置水平式离心机，1000rpm离心20min。 4、用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内。 5、加入5倍体积的Hanks液，手动旋转试管使液体混匀，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀即主要为淋巴细胞（或单位个核细胞）。加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml，混匀后进行计数。 （备注：如做淋巴细胞转化或其它培养，所用试剂、器材应是无菌的。尚需细胞存活率检查，见下页。） （一）T、B细胞分离技术 为了深入研究T、B细胞的生物学特性和功能，需从淋巴细胞群中分离出单一的T细胞或B细胞。根据T、B细胞膜表面标志及粘附能力等不同。可将二者加以分离。常用的方法有E花结形成法，尼龙棉柱法、免疫吸附法、免疫磁珠分离法等。应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或细胞亚群。 花环沉降法分离T细胞 绵羊红细胞（SRBC）能与人类T细胞形成E花环。经溴化二氨基异硫基异硫脲氢化物（AET）处理的SRBC，能与T细胞形成稳定而巨大的E花环。用淋巴细胞分离液分离时，AET-E花环沉于管底，在分离液界面的淋巴细胞为B细胞；沉于管底的AET-E花环经低渗溶液溶解花环周围的SRBC，即可获得纯的T细胞。 【村料】 1、AET溶液。 2、绵羊红细胞悬液。 3、淋巴细胞分离液。 4、含10％小牛血清、1640培养液。 5、Hanks 液。 6、生理盐水。 7、单个核细胞悬液。 【方法】 1、用AET处理SRBC：取绵羊红细胞悬液，加入Hanks 液，轻轻摇匀，1500rpm离心5min，共3次。取一份压积的SRBC，加入4份新配制的AET液混悬，置于37℃水浴15min，不断摇匀。加入冷生理盐水，混匀，1500rpm离心5min，并5次。观察无溶血，细胞凝集后，加入含小牛血清的1640培养液，混匀，离心同上。在1份SRBC中加入9份含10％小牛血清的1640培养液制成AET-SRBC悬液； 2、用含10％小牛血清的1640培养液稀释AET-SRBC悬液至