AYL-S7-321 G实验(1,3-β-D-葡聚糖)操作规范3.0.doc

编写者：沈继录 审核者： 批准人： 生效日期：2012.1.1 文件发放范围：微生物组 文件年度审核 审核者： 审核者： 审核者： 审核者： 日期： 日期： 日期： 日期： G实验（1,3-β-D-葡聚糖）操作规范 一、标本采集： 血液、脑脊液、胸腹水等无菌体液均可检测。 干管采血3ml，无需抗凝剂抗凝。 二、试剂盒组成：55次装试剂盒包含： 1.一瓶葡聚糖检测试剂 2.一瓶Pyrosol 缓冲液 3.一瓶(1,3)-β-D-Glucan标准品 4.一瓶试剂级水20 mL 5.重氮偶联试剂（仅包含在终点法试剂盒中） 一管盐酸 一管亚硝酸钠 一管氨基磺酸铵 一管NEDA（萘乙二胺） 一管N-甲基吡咯烷酮 6.一块96孔无热原微板 三、试剂保存条件：试剂在2-8°C的条件下避光保存。复苏的葡聚糖检测试剂可以在2-8°C保存2个小时；或者冷藏在-20°C条件下，可以保存20天，注意仅可冻融一次。而偶联试剂可以在使用前预制出来。 四、试剂盒中未提供的耗材 所有耗材都应没有葡聚糖干扰。实验用的玻璃器材都应在235°C烘烤7小时后再使用。而购 买的塑料耗材也应需有无葡聚糖干扰证明方可使用。 1.吸头*（250 μL - Cat# PPT25; 1000 μL - Cat# PPT10） 2.样品反应试管(13 x 100 mm - Cat# TB013) 3.玻璃移液管 4.a-动态法试剂-使用带有适当软件的酶标仪在405 nm波长读取OD值。（酶标仪需具备动态 孵育功能方可使用）。 b-终点法试剂- 使用酶标仪在540-550 nm读取OD值。 * 这些产品都证实没有葡聚糖干扰 五、检测步骤-终点法试剂(5 - 40 pg/mL 范围) 一）、预制试剂 1.准备标准品溶液1：注意每瓶标准品的β-glucan的含量有所差异，具体含量标注在瓶身上。 根据瓶身上的标注加入适量的试剂级水将标准品配置为100 pg/mL溶液。涡旋混匀至少一分 钟以保证其充分溶解。 2.预制40 pg/mL 的标准品溶液2：通过将600 μL试剂级水和400 μL 标准品溶液（ 第1步 中的）在一只无葡聚糖的试管中混匀来获得。 注意: 移液时尽量放慢速度以保证完全转移。 3.预制20 pg/mL 的标准品溶液3：通过将400 μL 试剂级水和400 μL 标准品溶液（ 第2 步中的）在一只无葡聚糖的试管中混匀来获得。 4.预制10 pg/mL 的标准品溶液4：通过将400 μL 试剂级水和400 μL 标准品溶液（ 第3 步中的）在一只无葡聚糖的试管中混匀来获得。 5.预制5 pg/mL 的标准品溶液5：通过将400 μL 试剂级水和400 μL 标准品溶液（ 第4步 中的）在一只无葡聚糖的试管中混匀来获得。 6.用2.8mL Pyrosol 缓冲液复苏葡聚糖试剂。轻轻的摇动小管至完全溶解。（注意不要涡旋 混匀） 注意：复苏后的葡聚糖试剂应该在10分钟以内使用，或保存在2到8°C下，可以保存2小时。 7.准备重氮偶联试剂： a. 加1N HCl稀释液（管1A）到亚硝酸盐中（管1）。 b. 加4.0mL试剂级水到氨基磺酸铵中（管2）。 c. 加一定量N-甲基吡咯烷酮（N-methyl-Pyrrolidinone）（管3A）到萘乙二胺（NEDA） （管3）。此溶液应该在实验当天制备并使用。 按照下面的步骤准备空白对照及标准曲线 按如下的准备两份： 1. 加50μL 的标准稀释液2（ 40pg/mL）到微孔板B2、B3孔中。 2. 加50μL 的标准稀释液3（ 20pg/mL）到微孔板C2、C3孔中。 3. 加50μL 的标准稀释液4（ 10pg/mL）到微孔板D2、D3孔中。 4. 加50μL 的标准稀释液5（ 5pg/mL）到微孔板E2、E3孔中。 5. 加试剂级水50μL到F2、F3中。 二）、实验步骤-终点法 1.加50 μL未知葡聚糖含量的样品到孔位中。 2.用连续加样器加50 μL葡聚糖检测试剂到每个孔位中，使用酶标仪在37°C ± 1°C 孵 育，孵育的时间参照试剂盒附带的COA（质量分析Certificate of Analysis）。 3.用连续加样器加每孔50 μL亚硝酸钠（管1）终止反应。然后加50 μL氨基磺酸按（管2）， 接着50 μL萘乙二胺（NEDA）（管3），每次加样时须更换吸头。发色反应会立即出现。将 微孔板置于540-550 nm波长下读取OD值。 4.使用酶标仪的软件做出标准曲线并计算出未知样品中(1,3)-β-D-glucan的含量。 六、结果报告： 将检测结果录入LIS系统患者的结果一栏中，保存审核后打印结果并发出报告。 七、正常参考值：60pg/ml 八、注意事项： 1. 相关系数 无论是动态