局灶性脑缺血后嗜酸性神经元死亡通路.docVIP

局灶性脑缺血后嗜酸性神经元死亡的通路 　　[摘要]目的 局灶性脑缺血后产生各种类型的嗜酸性神经元（ENs）。为了探讨大鼠局灶性脑缺血后大脑皮质中心区和周边区ENs的形态学特征，及细胞死亡相关因子在ENs中的表达。方法 夹闭蒙古沙鼠单侧颈总动脉制作前脑缺血模型，于3h至2周在显微镜下行ENs形态学和免疫组织化学分析。结果 光镜：细胞核轻度异常的ENs缺血3h后出现于中心区，12h后出现于周边区，calcium、μ-calpain、GRP78和ubiquitin在该型ENs中呈阳性。中心区，核固缩和胞体不规则萎缩的ENs缺血12h后达峰值，calcium、μ-calpain表达进一步增高；核固缩和胞体极度萎缩的ENs 4d后达峰值，calcium、TUNEL染色呈阳性。周边区，ENs的胞体轻度萎缩，于1周后相继呈现核固缩、核碎裂、核溶解，同时calcium、TUNEL染色呈阳性。活化型caspase 3在中心区与周边区的各型ENs中均呈阴性。电镜：中心区，ENs的染色质凝集成不规则团块状，细胞质中出现大量空胞，核膜及胞膜均破裂。周边区，ENs的染色质凝集、碎裂呈不规则团块，最终均质化，核膜边界模糊，胞膜仍保持完整。结论局灶性脑缺血后ENs呈现了两种死亡途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体轻度萎缩。ENs不同形态学的改变与不同细胞死亡相关因子的活化相对应 [关键词]calpam；嗜酸性神经元；前脑缺血；梗死；蒙古沙鼠 [中图分类号]R364.1 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）11-25-06 局灶性脑缺血导致两种类型的形态学损伤：选择性神经元死亡和梗死。临床和实验数据表明选择性神经元死亡位于梗死灶的周边部。嗜酸性神经元（eosinophilic neurons，ENs）是神经细胞缺血性损伤的一种形式，呈均匀一致的嗜酸性胞质染色及细胞核固缩、碎裂、溶解，常位于梗死的周边区。我们的研究显示：皮质高密度ENs区域进展为梗死，而低密度ENs区域进展为选择性神经元死亡。不仅ENs的细胞核发生固缩、碎裂、溶解，细胞体也从萎缩进展为肿胀。因此，脑缺血后出现各种形态的ENs，可能反映了不同的缺血程度、时间经过或细胞死亡机制 谷氨酸的异常大量释放及其诱发的钙内流是神经元缺血性损伤的上游通路，细胞坏死是缺血后细胞死亡的主要机制，而由caspase家族调控的细胞凋亡也被报道出现在脑缺血模型中。此外，细胞内蛋白质异常降解、依赖ATP的泛素一蛋白酶体功能障碍也可能参与了缺血后神经元死亡 我们使用梗死灶呈缓慢进展的沙鼠局灶性脑缺血动物模型，探讨局灶性脑缺血后大脑皮质ENs的形态学特征及细胞死亡相关因子在中心区与周边区ENs中的表达 1材料与方法 1.1一般材料 异氟醚（安耐吉化学）；二乙醚（上海麦克林生化科技有限公司）；多聚甲醛（北京索莱宝生物科技有限公司）；PBS缓冲液（北京雷根生物技术有限公司）；山羊血清（北京索莱宝生物科技有限公司）；茜素红（AMR，Solon，Ohio，USA；1%）；细胞凋亡原位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；锇酸磷酸盐缓冲液（广州竞赢化工科技有限公司）；柠檬酸铅（安耐吉化学）；乙酸双氧铀（成都麦卡希化工有限公司）；坏死相关蛋白酶抗体―mouseanti-μ-calpain（Chemicon；1：500稀释）；细胞凋亡因子抗体―rabbit anti-actived caspase 3-p17（RD Systems，Minneapolis，MN，USA；1：500）；内质网应激蛋白抗体―mouse anti-GRP 78（Santa Cruz Bioteehnology；1：800）；蛋白质降解标志抗体―蛋白质降解标志物抗体―rabbit anti-ubiquitin（Dako Cytomation，Glostrup，DK；1：1000） 1.2实验动物 雄性蒙古沙鼠87只，16～20周龄，体重（66±6）g，购自三共制药（Sankyo，东京）实验动物中心。实验按照全国卫生研究所制定的关爱和使用动物用于研究的指导方针和学校动物实验委员会的管理条例进行 1.3实验方法 1.3.1动物模型的制备 2%异氟醚麻醉，切开左颈皮肤，分离左颈动脉用小动脉夹夹闭10min诱发脑缺血。在颈动脉夹闭后进行卒中指数（strokeindex，SI）评分（总分25分），见表1；SI≥10可进展为脑梗死。为减少缺血性损伤的个体差异，我们选择卒中指数14～17分（n=28）的动物作为“缺血动物”用于后续实验，5h后以相同的处理方式再次使动物缺血10min。两次缺血处理比单次缺血处理动物死亡率低。假手术组（n=4）以相同手术方式处理，但左侧颈动