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海洋动物目的基因的发育表达图式 一、实验目的： 1、掌握RNA 原位杂交的原理，用以指导今后的实验工作。 2、熟悉胚胎整体原位杂交操作技术，并对实验操作注意事项加以分析、总结。 3、通过扇贝基因的发育图示，加深对发育过程中基因表达时空特性的理解。 二、实验原理： （一）组织原位杂交技术原理： 组织原位杂交技术是一种应用标记探针与胚胎或组织细胞中的待测核酸杂交（碱基 配对），再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技 术。 （二）整体原位杂交（Whole-mountin situhybridization）技术原理： 整体原位杂交是将目的基因的探针与胚胎整体进行杂交的方法，区别于切片原位杂 交。 （三）RNA 原位杂交原理： RNA 原位杂交主要是利用碱基互补原理，将体外合成的带有标记的单链反义 RNA （RNA 探针）与组织或细胞中待测的mRNA 发生杂交，从而将探针定位在特定基因的 表达区域内。显色观察，确认其表达部位。 （四）标记物的种类分为2种，即非放射性的标记物和放射性的同位素标记物。前者如： 32 14 地高辛(DIG)和生物素(BIO)，后者如： P、 C等。 如上图所示意： 实验操作中，先将组织固定，然后用地高辛标记的正、反义RNA 分别与对照组和实 验组进行杂交。根据碱基配对原理，在实验组，反义的RNA 与组织中特异表达分布的 mRNA进行杂交；而在对照组中，正义的RNA 不能与mRNA 杂交。第三步是添加抗体， 抗体特异性地与地高辛结合。在显色过程中，抗体上连接的酶将底物分解，显现出特定 的颜色。实验组和对照组的区别在于探针能否与mRNA 杂交，实验组的能杂交，因而最 终显色，对照组的探针与mRNA 同源，不能杂交，在各步洗涤过程中被清除掉，因而也 就不能特异性地显色。 三、实验材料： （一）实验动物： 栉孔扇贝胚胎和幼虫。 （二）实验试剂： 100%甲醇、PBT液、蛋白酶K（50ng/ml）、TEA（0.1M）、4%聚甲醛、预杂交液、 探针（工作浓度1 μg/ml ）、Hybridization buffer、2×SSC 液、0.2×SSC液、MaNaT （马来酸）、Blocking Buffer、抗地高辛抗体、APbuffer、 NBT/BCIP、70%酒精、80% 甘油、梯度乙醇（85%、、95%和100%）、二甲苯、中性树脂等。 （三）实验仪器设备： 显微镜、移液枪、枪头、离心管、离心管架、口罩、一次性PC 手套、载玻片、盖玻 片等。 （四）目的基因：vasa基因——生殖细胞的标记分子。 四、胚胎原位杂交的实验流程： （一）实验准备： RNA 探针设计合成。 胚胎固定：4％多聚甲醛(PBS 配制)， 保存于100%甲醇中（-20℃）。 试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180 ℃。 （二）原位杂交流程： （1）取存于100%甲醇的样品置于梯度甲醇/PBT（3/1;1/1;1/3）中依次复水约10min， 使样品完全沉于管底。 （2）复水后用1ml PBT 洗2 次；每次10min。 （3）500μl蛋白酶K（50ng/ml），37 ℃水浴中作用15min。 （4）500μl TEA（0.1M）处理2次，每次10min。 （5）1mlPBT洗2次，每次10min。 （6）1ml4%聚甲醛后固定20min。 （7）1mlPBT 洗5 次，每次10min。 （8）PBT/预杂交液（1：1）室温10min。 （9）放在500ul 预杂交液中于60℃水浴锅中预杂交至少3h。 （10）加入探针（工作浓度1 μg/ ml ），杂交过夜（一般不少于16h）。 （11）60 ℃洗脱： Hybridization buffer/2×SSC（1/1）洗20 min。 Hybridization buffer/2×SSC（1/3）洗20 min。 2×SSC洗20min。 0.2×SSC+0.3