实验7 食品中硫胺素VB1的提取、纯化和测定分析.docVIP

实验七 食中硫胺素的测定 了解硫胺素测定的原理和意义。 掌握荧光法测定硫胺素含量的操作要点和注意事项。 了解荧光分光光度计等相关仪器的使用方法。 二、原理与意义 食品中VB1的存在形式：①常以游离态存在；②复合脂形式存在（磷蛋白）；③辅羧酶形式存在； VB1在绿色蔬菜、米糠、麦胚、花生、黄豆、牛乳、蛋黄和酵母中比较丰富，动物组织不如植物中含量丰富。 VB1为白色结晶，在中性、碱性条件下不稳定，易分解；在酸性条件下稳定，即使加热；易溶于水，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3。 样品经热稀酸处理，以提取维生素B1；如样品中含杂质过多应经过离子交换剂处理使硫胺素与杂质分离。在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素在紫外线下噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下以及没有其荧光物质干扰时此荧光强度与噻嘧色素量成正比即与溶液中硫胺素量成正比 三、仪器、器材与试剂 仪器试剂 仪器 试剂 器材 高压蒸汽灭菌器 2台 盐酸 1瓶 研钵8cm 2个 恒温培养箱 1台 无水乙酸钠 2瓶 三角瓶100ml 20个 荧光分光光度计 1台 溴甲酚绿 1瓶 烧杯100ml 10个 组织捣碎机 1台 氢氧化钠 2瓶 烧杯50ml 10个 粉碎机 1台 淀粉酶 1瓶 移液管25ml 10个 可调电炉（电磁炉） 2～4台 蛋白酶 1瓶 脱脂棉 1包 蒸馏水发生器 1台 人造浮石 2瓶 Maizel-Gerson反应瓶 40个 乙酸 2瓶 容量瓶 1000ml 5个 氯化钾 3瓶 500ml 2个 氯化钙 2瓶 250ml 2个 铁氰化钾 2瓶 100ml 10个 正丁醇（优级纯 无水硫酸钠 1瓶 盐基交换管 20个 白点滴板 10个 量筒50ml 10个 样品（绿色蔬菜） 溶液配制 0.3mol/L盐酸25.5ml浓盐酸用水稀释至1000m。 2mol/L乙酸钠164.0g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000m。 25%氯化钾：250.0g氯化钾溶于水中，稀释至1000ml（配3L 2L装入一个2.5L的大试剂瓶，用来配溶液1L用来活化浮石）。 25%酸性氯化钾8.5ml浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000m。ml浓盐酸25%氯化钾溶液。 15%氢氧化钠g氢氧化钠溶于水中稀释至00ml（塑料或橡胶瓶塞）。 1%铁氰化钾：g铁氰化钾溶于水中，稀释至0ml，当天配制，棕色瓶内保存。 碱性铁氰化钾取ml的1%铁氰化钾溶液用15%氢氧化钠溶液稀释至0ml。避光使用。 3%乙酸溶液ml冰乙酸水稀释至人造浮石。 活性人造浮石称取00g的40～目的人造浮石以～10倍于其容积的热3%乙酸搅洗2次每次10min再用5倍于其容积的热25%氯化钾搅洗15min然后再用3%乙酸搅洗10min最后用热蒸馏水洗至没有氯离子蒸馏水中保存。0.1mol/L盐酸：0.85ml浓盐酸，用水稀释至100ml。0.01mol/L盐酸0.1mol/L盐酸0ml，用水稀释至00ml。 硫胺素标准贮备液准确称取mg经氯化钙干燥24h的硫胺素0.01mol/L盐酸稀释至0ml（冰箱中避光可保存数月。 硫胺素标准中间液μg/ml）：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释0倍ml，定容100ml；冰箱中避光可保存数月。 硫胺素标准使用液μg/ml）：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍ml，定容500ml），用时现配。氢氧化钠（0.1mol/L）：0.2g氢氧化钠溶于水中，稀释至100ml。 溴甲酚绿溶液0.04%）：称取0.g溴甲酚绿置于小研钵中加入.56ml的0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻再加入少许水继续研磨至完全溶解水至0ml。 操作步骤 样品采集后用匀降机打成匀浆或者将样品尽量粉碎于低温冰箱中冷冻保存用时将其解冻后使用。 2 提取 2.1100ml三角瓶精确一定量试样估计硫胺素含量为10～30μg一般称取～0g试样加入50.3mol/L（或0.1mol/L盐酸瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解121℃下30min，凉后取出。 2.2 用2mol/L乙酸钠调其H值为4.510ml左右，以0.04%溴甲酚绿为外指示剂，由淡黄变淡绿即可。 2.3 按每克试样加入20mg淀粉酶0mg蛋白酶的比例加入淀粉酶酶45～50℃温箱约16h。 2.4 冷至室温定容至100后混匀过滤即为提取液。 3 净化 3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换的交换柱底部加水将棉纤维中气泡排出再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度保持盐基交换中液面始终高于活性人造浮石。 3.2 用移液管加入提取液硫胺素标准使用液20～0ml，记录体积（使通过活性人造浮石的硫胺素总量为2～μg）。 3.3 加入约10热水冲洗交换柱弃去洗液重复三次，可用30～