朊蛋白促进胃癌增殖的分子机制.doc

论文中英文摘要格式 作者姓名：梁洁 论文题目：朊蛋白促进胃癌增殖的分子机制 作者简介：梁洁，女，1980年3月出生，2003年8月师从于第四军医大学樊代明教授攻读硕士学位，同年通过硕博直读选拔，面试攻读博士学位；于2008年6月获博士学位。 中 文 摘 要 【背景】 朊蛋白是一种脂筏锚定蛋白质，分正常型PrPC和致病型PrPSc两种。尽管PrPC基因敲除小鼠的研究，提示PrPC缺失后小鼠会出现心律失常、昼夜节律改变等症状，但是PrPC的功能至今还不清楚。 既往研究提示，PrPC编码基因的突变或性与疾病相关，PrPC在神经系统发挥作用也与抗氧化、抑制细胞凋亡密切相关。此外，PrPC在神经系统主要表达在增殖较快的脑组织区域，在外周具有快速更新特征的胎盘等组织中富集，提示PrPC在细胞的增殖中发挥了一定的作用。 本实验室在前期研究中最先发现PrPC在胃癌耐药细胞系中高表达，提示其与胃癌的多药耐药相关。Pammer等发现胃粘膜腺颈处有PrPC弱阳性表达，且随着幽门螺旋杆菌的感染表达增加，而幽门螺旋杆菌感染是胃癌发生的重要原因之一，PrPC在胃癌中的表达、定位及其对胃癌增殖的作用和机制尚不清楚。本课题将对此进行探讨，明确PrPC对胃癌增殖的作用及机制。1、研究PrPC及其缺失突变体在胃癌中的表达情况；2、明确PrPC与胃癌细胞凋亡、增殖的相关性；3、研究PrPC抑制胃癌细胞凋亡、促进胃癌细胞增殖的可能机制；4、探讨PrPC促进胃癌细胞增殖的信号转导通路及其在胃癌中高表达的可能原因。 【方法】 1、利用免疫组织化学、免疫荧光技术观察PrPC在胃癌组织细胞中的表达、定位；2、通过DNA琼脂糖电泳及PAGE检测胃癌组织及细胞中PrPC编码基因的缺失突变况；3、通过基因重组方法构建PrPC的正义全长、siRNA载体及各功能结构域的缺失突变体，分别转染胃癌细胞系构建筛选稳定转染细胞；4、利用流式细胞仪、免疫荧光等技术研究PrPC对胃癌细胞凋亡的影响；5、利用基因芯片筛选参与PrPC抑制胃癌细胞凋亡的相关基因，并通过Western Blot进行验证；6、通过MTT、流式细胞仪检测细胞周期、细胞周期同步化阻滞、平板克隆和软琼脂克隆形成以及裸鼠体内成瘤等体内外实验研究PrPC对胃癌细胞增殖、生长的影响；7、用RT-PCR、Western Blot及双荧光素报告激酶实验检测各种转染有PrPC的胃癌细胞系对CyclinD的表达及转录激活作用；8、通过基因芯片筛选相关信号转导通路，通过Western Blot检测磷酸化Akt及总Akt的表达水平；9、通过缺氧孵箱或CoCl2诱导检测缺氧条件下PrPC的表达。 【结果】 1、PrPC及其缺失突变体(1-OPRD)在胃癌中高表达 本研究利用胃癌癌旁组织标本和超英公司提供的胃癌、癌旁正常胃粘膜组织芯片，通过免疫组织化学和免疫荧光的方法，发现PrPC在胃癌中表达的(1.80±0.183)明显高于正常胃粘膜(0.74±0.075)(p0.05)。PrPC在胃癌中的表达与分级和分期相关，但与患者的年龄和性别等因素无关定位在胃癌细胞的细胞浆和/或细胞膜上。Western Blot检测发现其在各种胃癌细胞系中表达无明显差异，SGC7901表达相对较低，AGS表达相对较高。 用特异性PCR及琼脂糖电泳检测发现，胃癌细胞系中存在着杂合或者纯合PrPC(1-OPRD)缺失突变体。MKN28和KatoⅢ为PrPC(1-OPRD)的纯合缺失突变体，SGC7901和BGC-823为杂合缺失突变体，而胃癌细胞系AGS、MKN45 以及永生化胃粘膜上皮细胞系GES不存在PrPC(1-OPRD)的缺失突变。103例胃癌病人血液样品提取的基因组DNA，用特异性PCR检测出3例PrPC(1-OPRD)杂合缺失突变体(突变率2.9%)，205例正常人血液样品中只检测到1例突变(突变率0.5%)；56例胃镜下取样病理活检证实为胃癌组织的样品中检测到5例(突变率8.9%)；63例胃镜下取样病理活检证实为正常胃粘膜组织的样品未检测到PrPC(1-OPRD)缺失突变体。说明PrPC(1-OPRD)缺失突变体在胃癌血液标本中的突变率明显高于正常血液样品中的突变率(p=0.047)，而PrPC(1-OPRD)缺失突变体在胃癌粘膜中的突变率也高于正常胃粘膜中的突变率(p=0.021)。 2、PrPC通过上调Bcl-2、下调Bax，抑制细胞色素C的释放抑制胃癌细胞凋亡 将构建转染正义和siRNA PrPC的胃癌细胞系，通过血清剥夺诱导后利用电镜流式细胞仪、免疫荧光等发现，转染PrPC的胃癌细胞具有抑制胃癌细胞凋亡及活性氧自由基释放的作用。用基因芯片筛选参与PrPC抑制胃癌细胞凋亡的相关分子，进一步通过Western Blot检测发现正义PrPC转染