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第三章 细胞生物学研究方法;第三章 细胞生物学研究方法;一、光学显微镜技术light microscopy;电子显微镜的基本知识 主要电镜制样技术 扫描电镜;三、扫描遂道显微镜  （ scanning tunneling microscope ，STM）;荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）;激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）;?微分干涉显微镜 （differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器 ?录像增差显微镜技术 （video-enhance microscopy） 计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下 研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动; 电子显微镜与光学显微镜的基本区别;电镜与光镜光路图比较;电子显微镜的基本构造;主要电镜制样技术;扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）;;☆ 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统 ☆ 光学显微镜成像原理;;;;;通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(如细胞质),速度快;;;;;;;;;;;;;;1. 普通光学显微镜;1 数值孔径（镜口率）NA：指光镜的汇聚能力， N.A = n · sinα/2 注： α--镜口角， n--介质折射率。 空气--1、水--1·33、香柏油--1·515、溴萘--1·6 镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。 α角小于180°，α/2小于90°，sinα/2最大值不超过1，因此N·A不会超过1。目前最好的显微镜α=140 °;一般的显微镜上标明10× /0.65、0.75、0.8等，就是指数值孔径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，α大，张角大，光通过的多、亮，透性好清晰;光学显微镜物镜的特性;2 分辨力/率（resdving power）：R， 指25cm明视距离处，能分辨清楚尽可能靠近的两个质点的能力。辨认两点之间的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为100μm，（实际上200μm才是理想的）。而显微镜分辨力则以下公式计算： R =0·61λ/N.A λ-光源的波长;波长是定值（400nm~700nm），后者情况如何呢？;3 放大倍数/率（magnification）：M 是最终成像的大小 与原物体大小的比值（指长度） 目镜放大倍数MF目= 250mm （明视距离）/F目（目镜焦距） 物镜放大倍数MF物= 160mm ( 标准光学筒长) /F物(物镜焦距) 总放大倍数MF总= 标准光学筒长/F物 × 250/F目 = 物镜放大率×目镜放大率 M 是否越大越好？怎样提高M ？;F目不能太短，因人眼瞳孔要与出射光孔重合，在10 mm以上，放大率不高，约在（250/10）25，光学筒长（A）不能无限长，所以只有靠减小F物来提高总放大倍数。 光镜有效放大倍数受到分辨力限制，只要将R=0.2μm，放大到人眼分辨力（0.2 mm）大小，便能观察该物体。0.2 mm ×103/0.2μm=103（倍），超过此界限继续放大，人眼就看不清其细节，是模糊的空放大，无意义。;☆ 有效放大： 上限：物镜镜口率×1000 ； 下限：物镜镜口率×250； 可变光阑（光圈）可调节开孔大小使聚光镜的N.A适应于物镜的N.A，如果聚光镜的N.A小于物镜N.A，则造成物镜N·A不能充分发挥。 ☆正确匹配目、物镜，以保证物象清晰度。 显微镜适合的放大倍数 决定于物镜的数值孔径，一般应为NA的 500-1000倍，M=NA×（500-1000）。 在选择放大倍数时，一定注意镜头的匹配，在物镜与目镜的组合中， 目镜有效放大倍数为： M=目镜倍数（O）×物镜倍数（B） O×B=NA×（50