玉米陈化关键酶基因Zmlox-2的RNA干扰载体的构建%.pdf

华 南 理 工 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ） 第44卷第3期 Journal of South China University of Technology Vol . 44 No . 3 2016年3月 (Natural Science Edition ) March 2016 文章编号：l〇〇〇-565X (2016)03-136-06 玉米陈化关键酶基因^ ^ - 2 的 RNA干扰载体的构建% 韩颖1 赵寿经 u 杨瑜1 孙尧2 王乐1 (1 .吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022 ; 2 .长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012 ) 摘 要 ：脂肪酸氧化酶（L 0X )催化不饱和脂肪酸过氧化反应，导致玉米（Zea mays L .)种 子储藏品质的下降.为抑制玉米陈化关键酶基因ZmZ 0*-2的表达，依据 R N A 干扰原理，针 对玉米Z m — 基因进行克降，采用重组P C R 及酶切连接技术成功构建了 Z m — 基因 的 R N A 干扰植物表达载体，并将重组载体PRI 101-〇n —m 〇*-2-RNAi通过热激转化法转化 到根癌农杆菌中.实验结果表明ZmZ 〇*-2基因的R N A 干扰表达载体构建正确，这为下一 步诱导遗传转化、探索陈化酶基因的干扰表达效果奠定了理论和实验基础. 关键词：生物工程；陈化 ;R N A 干扰表达载体;重组P C R ;脂肪酸氧化酶 中图分类号：Q 81 doi ： 10.3969/j. issn. 1000-565X . 2016.03.019 玉米是脂质含量较高的粮种，其胚芽中的油脂 L0X 酶活性以提高储藏品质，已经做了一些研究工 约占总重的3. 1% ~ 7.0%.近年来的研究表明，玉 作，例如微波辐射、低温气调储存等[].但是这些方 米贮藏期间脂质的降解是导致其品质下降并产生令 法消耗大量的物质资源和能量，还导致种子蛋白质 人不快气味的主要原因之一.脂肪酸氧化酶（L 0X ， 的变性.因此通过R N A 干扰技术（RNAi )抑制玉米 EC 1.13.11.12)是脂质降解的关键酶，其催化多元 Z〇*-2基因的表达量有可能成为改善玉米储藏品质、 不饱和脂肪酸过氧化反应，然后经过裂解酶分解形 延缓种子陈化衰老的有效手段[9]. 成短链的丙二醛（M D A )等挥发性物质，导致玉米储 本研究利用P C R 重组技术，克隆玉米fer -2基 藏过程中品质下降[1 4 .脂肪酸氧化酶是一个多基因 因（Zm— )的特异序列，构建成含Zox基因反向重 家族，玉米种子中共发现3 种 L 0X 酶，其中 L 0X -2酶 复结构(正反义片段之间间隔一段含有多克隆位点 可能是导致储藏品质下降的关键酶.因此从理论上 的序列，便 利 转 录 后 形 成 具 有 “发夹结构”的 讲，玉米L 0X -2酶的缺失可以明显地阻止脂质过氧 dsRNA )的 RNA 干扰表达载体（PRI101-〇n -Zm— - 化作用，减缓贮藏玉米氧化变质的速度，保持清新气 RNAi )，将其转导入根癌农杆菌中，获得RNAi表达 味，提高耐贮性.上述推测己经在玉米脂肪酸氧化酶 载体基因工程菌.ZmZ—-2基因的RNAi表达载体的 L 0X -2 (玉米种子中主要的L 0X 同工酶）缺失体与 构建为后续的遗传转化及探讨ZmZ—-2基因的沉默 耐贮性关系的研究中得到了初步证实[57].针对玉 表达对延缓玉米陈化的作用提供了研究素