第6章 常用分子生物学技术(药学本科)-2012.pptVIP

4、基因芯片应用 可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。 如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？ Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； 21-23nt. 2-nt 3 overhangs ( UU overhangs ). G/C 含量: 30-50%. 无不配对碱基. BLAST : eliminate any target sequences with significant homology to other coding sequences. design and test 3–4 siRNA sequences 用siRNA表达质粒 或病毒表达载体：高效。 1. 化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 ) 2. 双脱氧链末端终止法 (Sanger ,1977) 3. DNA自动化序列分析 3、肿瘤治疗 用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。 (1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因， (2)RNAi应用于抑制插入基因及融合基因表达， (3)RNAi可应用于抑制基因扩增。 3、肿瘤治疗 Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7发挥其抗凋亡作用 。现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的敏感性，从而提高肝癌治疗的整体疗效。 3、肿瘤治疗 MDR (Muhidrug resistance)是肿瘤化疗失败的主要原因，形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过度表达，其中，MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用。Nieth等表明，特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达，从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。 4、药物开发 利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。 七、SiRNA的设计与制备 发夹结构siRNA中环的长度和序列 hpRNA :55% ihpRNA: 90% ihpRNA overhang :80% 、ihpRNA spacer :89% ihpRNA这种构建抑制效率最高，抑制效率均在90%左右 siRNAs的制备 化学合成； 体外转录； 长链 dsRNA 用 RNase III家族酶如 Dicer, RNaseIII等消化。 质粒和病毒载体 化学合成的siRNA质量高。 量多、纯度高。 非常昂贵。 比较适合需要量大、确定的siRNA 序列。 不适合筛选siRNA序列。 序列： 从起始密码子下游50-100bp. 大约21-23个核甘酸： AA(N19)TT 5’磷酸，3’羟基 化学合成 体外转录 费用适中 比较容易转染 比较适合筛选 siRNA序列 不适合需要大量单链siRNA序列的研究  长链dsRNA 用RNaseIII类酶消化 long dsRNA: 200–1000 nt (in vitro transcription) digest in vitro with RNase III (or Dicer) remove any undigested dsRNA Transfection 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 六、基因敲除进展与应用 常规基因敲除的基础上又发展了： 1、条件性基因敲除、 2、体细胞基因敲除、 3、基因诱捕等新技术。 基因诱捕（gene trapping） 基因诱捕又称随机基因敲除，它不是利用外源基因与基因组同源序列进进行同源重组，而是利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来。 基因捕获法的基本原理图 中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。 根据所诱捕的表达调控序列的不同，