骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭与`Akt磷酸化影响.docVIP

骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响 　　[摘要]　目的　探讨骨桥蛋白（osteopontin，OPN）基因对大肠癌细胞侵袭的影响及机制。　方法　以人大肠癌Colo　205细胞为模型，应用OPN基因小干扰RNA（small　interfering　RNA，siRNA）转染处理后，采用荧光实时定量PCR检测OPN基因　mRNA水平，采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖能力，采用Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力，采用蛋白质印迹检测癌细胞Akt磷酸化水平。　结果　OPN转染组癌细胞OPN　mRNA和蛋白水平明显被抑制，且与时间和浓度相关。与空白对照组比较，OPN转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。蛋白质印迹检测发现，OPN转染组细胞Akt磷酸化水平明显下调。　结论　OPN基因转染可明显下调大肠癌细胞的增殖和恶性侵袭能力，下调Akt磷酸化水平，是OPN基因转染下调癌细胞的增殖和恶性侵袭能力重要机制之一 [关键词]　大肠肿瘤；骨桥蛋白；侵袭；Akt；磷酸化 [中图分类号]　R735.3+4 [文献标识码]　A [文章编号]　1673-7210（2012）12（b）-0055-03 大肠癌（包括结肠癌和直肠癌）近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白（osteopontinin，OPN）与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月～2012年6月，本课题组借助于RNA干扰（RNA　interference，RNAi）技术，以大肠癌Colo205细胞为模型，对其采用OPN基因小干扰RNA（small　interfering　RNA，siRNA）转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路（Akt）方面探讨了分子机制 1　材料与方法 1.1　材料 人大肠癌细胞Colo　205购自美国ATCC公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN基因siRNA的正义链序列：GAA　ACU　CCC　UGU　AAA　CUA　A　dTdT；反义链序列：UAA　GUU　UAC　AGG　GAG　UUU　C　dTdT，由美国Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗体购自美国Santa　Cruz公司。其他RNA提前试剂（Trizol，RNase抑制剂），和逆转录试剂（SSRTⅡ、Taq　酶）及转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司 1.2　细胞培养及转染处理 人大肠癌Colo　205细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将浓度为1.0×105/mL的细胞接种于24孔培养板24　h后，待细胞长满60%～70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组（Con-A）：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组（Con-B）；③错配siRNA体对照组（Con-C）；④不同浓度的siRNA组：10%胎牛血清的RPMI-1640中含不同浓度（6.25、12.5、25.0　nmol/L）的已用脂质体包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行试验 1.3　OPN基因mRNA水平检测 根据文献[3]，采用荧光实时定量RT-PCR检测OPN基因mRNA水平 1.3.1　RNA抽提 应用Trizol抽提细胞总RNA。弃尽培养液，加入0.5　mL的Trizol试剂，反复吹打，转移到1.5　mL的eppendorf　管中，加入0.2　mL的氯仿，振荡混匀15　s，室温放置5　min后，　4℃条件下15　000　g离心15　min，吸取上清置另一新的eppendorf　管中，加入0.5　mL　Trizol试剂体积的异丙醇，混匀后室温放置10　min，4℃条件下15　000　g离心10　min，弃上清，沉淀加75%乙醇，7　500　g离心5　min洗涤1次，室温放置10　min左右，加入10　μL的0.1%DEPC水溶解，260　nm测光密度，用40　μg/mLOD计算RNA浓度，用0.1%DEPC水调节浓度至200　ng/μL，备用 1.3.2　逆转录 取1　μg总RNA，加1　μL　oligo-dT（15　mer），70℃孵育10　min，然后迅速放在冰上冷却2　min，加入以下试剂：5×1　st　strand　buffe