实验4 DNA指纹图谱分析.doc

PAGE PAGE 14实验4 DNA指纹图谱分析4.1 相 关 基 础 知 识图1.图1. DNA指纹图谱的孟德尔方式遗传图2 传统指纹鉴定技术(a)和DNA指纹图谱鉴定技术(b) DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109图2 传统指纹鉴定技术(a)和DNA指纹图谱鉴定技术(b) 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记；在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程；在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象，电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。4.2 实 验 目 的 和 要 求掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程；学习DNA的限制性酶切的基本操作技术；掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。4.3 实 验 材 料、试 剂 和 仪 器4.3.1 实验材料犯罪现场DNA样品（CS）、嫌疑犯1 DNA样品（S1）、嫌疑犯2 DNA样品（S2）、嫌疑犯3 DNA样品（S3）、嫌疑犯4 DNA样品（S4）、嫌疑犯5 DNA样品（S5）化学试剂和溶液DNA样品反应缓冲液：100mM Tris, 200mM NaCl, 20mM MgCl2, 2mM DTT, pH 8.0。EcoRⅠ限制性内切酶PstⅠ限制性内切酶（4） 电泳缓冲液 （50×TAE，1000ml）Tris 242g冰醋酸 57.1mlEDTA（0.5mol/L pH 8.0） 100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。样品缓冲液（DNA sample loading dye）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青40%（W/V）蔗糖溴化乙锭（EB） 10mg/ml琼脂糖agarose（电泳级）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢ DNA markers仪器设备和消耗品电泳仪；电泳槽；样品梳；微波炉；水浴锅；微量移液器（10μl，200μl，1000μl）；离心管；一次性枪头（200μl，1000μl）。4.4 实 验 方 法 与 步 骤4.4.1 DNA样品的制备采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37℃孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA。由于一般采集的样本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技术扩增出完整的基因组DNA或者特定的高可变位点，以此制备出的DNA样品备用。 DNA