第六与章真核基因在大肠杆菌中的表达.pptVIP

第六章 真核基因在大肠杆菌中的表达;真核基因的大肠杆菌表达体系 大肠杆菌的表达载体 克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素;大肠杆菌表达体系 克隆基因正确表达的基本条件 克隆基因表达活性的检测; 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解； 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体； 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达； 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。;3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。; 最基本条件：应该能够进行正常的转录和转译，在正常情况下，还与转译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。 重要条件：编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性。;1.微细胞检测法； 2.巨细胞检测法； 3.偶联反应测定法。; 这是一种适于检测质粒基因表达的体内检测法。 微细胞：指由某些细菌突变体菌株在其生长期间连续产生的一类微小的圆形的无核细胞。 ;Example: ColE1的衍生质粒（缺失了106dal）, 在微细胞中不能合成出56×103dal、 42×103dal、30 × 103dal、 28×103dal四种多肽。其中3种多肽是大肠杆菌E1的降解产物。当一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片断插入到卡那霉素基因内部时，便能在微细胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2种其它的多肽分子。;巨细胞检测法 1. 经紫外线照射的大肠杆菌recA uvrA细胞，DNA停止合成，而质粒载体则可以继续合成，在紫外线照射后6小时，细胞内质粒DNA的数量增加了10倍左右，在紫外线照射后的几个小时内，加入经放射性标记的氨基酸，此时合成的蛋白质绝大部分是质粒基因所编码的。; 2.将含有外源基因的λ噬菌体重组子，感染到事先经过紫外线严格照射的大肠杆菌细胞上。由于细胞经紫外线照射使DNA受到了损伤，自身基因的表达受到了严重的抑制。通过同λ噬菌体载体编码的蛋白质种类作比较，就可以鉴定出克隆基因编码的蛋白质产物??;偶联反应测定法 使DNA模板在细菌无细胞体系中，进行转录－转译偶联反应。经过改良的这种体系中，可以使克隆在细菌质粒或噬菌体基因组上的外源片断进行体外表达，就可以比较容易的确定多肽片断是由编码模板上的哪个小片段指导合成的。 ; 优点： 1. 放射性标记参入到蛋白质的效率，比体内标记法高的多，而且这个系统十分敏感。经35S标记的多肽分子，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影若干小时后可被迅速检出； 2. 应用这个体系，其它原核生物的基因也能够得到有效的表达。;大肠杆菌表达载体;核糖体结合位点; 最佳启动子具备的条件 第一 必须是启动子能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 ;Example:;IPTG; 野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即Plac UV5 ; 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。 ;强化转录终止的必要性：; 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。; 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。 终止子也可以通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选;3.核糖体结合位点;大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特