聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程优化.pdf

第5 卷第1 期 过 程 工 程 学 报 Vol.5 No.1 2005 年 2 月 The Chinese Journal of Process Engineering Feb. 2005 聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子反应过程的优化 1,2 2 3 1 2 2 杨瑞娥 贠 强 陈 婷 谭天伟 马光辉 苏志国 (1. 北京化工大学化学工程学院 北京 100029 ; 2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 北京 100080 ; 3. 北京科技大学生物工程系 北京 100083) 摘 要 采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰重组人粒细胞集落刺激因子 rhGCSF 考察了各因素对蛋白质平均修饰 度及体外生物活性的影响 并对修饰产物的稳定保存条件进行了初步探讨. 通过四因素四水平正交法和单因素实验结 合 优化修饰条件为 PEG 与GCSF 摩尔比为25:1, pH 7.6 的硼酸盐缓冲环境 反应时间40 min 反应温度22 . 在 此条件下 PEGGCSF 的平均修饰度为50 活性可保留40左右.研究还发现 不同的添加剂影响PEGGCSF 的保存稳定性 人血清白蛋白和甘露醇是两种效果最好的保护剂 在它们的存在下 PEGGCSF 溶液在4 放置一 个月后活性保留92 三个月后保留51. 关键词 粒细胞集落刺激因子(GCSF) 单甲氧基聚乙二醇(mPEG) 化学修饰 生物活性 中图分类号 Q511 文献标识码 A 文章编号 1009606X(2005 1 前 言 应条件进行优化 探讨了各因素对修饰度大小和GCSF 生物活性的影响以及修饰度和生物活性之间的关系 同 [1] 1977 年 Abuchowski 等 用单甲氧基聚乙二醇 时确定了PEGGCSF 偶联物的稳定保存条件. (CH O [CH CH O] CH CH OH 简写为 mPEG)对 3 2 2 m 2 2 牛血清白蛋白和过氧化氢酶(小牛肝脏)进行化学修饰 2 材料和方法 后 发现用聚乙二醇偶联之后的蛋白质免疫原性和抗原 性大大降低 表观分子量和在体内的循环半衰期明显增 2.1仪器与材料 加. 随后人们用mPEG 对L天冬酰胺酶 超氧化物岐化 F4500 荧光仪( 日本Hitachi 公司) 450 型酶联免 酶 干扰素 粒细胞集落刺激因子等多种药物蛋白进 疫检测仪(美国BioRad 公司). 行了化学修饰 表明用mPEG 修饰后的蛋白可以减少人 荧光胺(Sigma), MTT(Sigma), RPMI1640 (Gbico 体对药物蛋白的免疫反应 延长药物在体内的循环时 BRL 公司), 96 孔细胞培养板(Costar 公司), rhGCSF 效 [2] 价测定用参考品( 中国药品生物制品检定所), 间 同时达到减少注射频率和药物毒副作用的目的 . rhGCSF(北医联合生物工程公司). 标准蛋白购自上海 粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimu- 丽珠东风生物技术有限公司. 试剂均为分析纯或生化纯, l