大肠杆菌PCR检测方法.doc.doc

ICS11.220 B41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/ XXXXX—XXXX 大肠杆菌PCR检测方法 Method of PCR for the detection of Escherichia coli 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶 大肠杆菌PCR检测方法 范围 本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。 本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。 E.coli：大肠杆菌（Escherichia coli） DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate） bp：碱基对（base pair） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate） Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer） 原理 根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。 无水乙醇：-20℃预冷%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷DNA聚合酶：Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）dNTP(2.5 mmol/L)。 引物：引物浓度为20μmol/L；上游5’- GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’， 下游引物5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’。 阴性对照：灭菌双蒸水阳性对照：E.coli ATCC25922无菌生理盐水TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液溴化乙锭DL2000 DNA Marker。 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装样品的采集、前处理、存放与运输内容物的采集与前处理粪便的采集与前处理取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号每管加入800μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200 μL，颠倒混匀后，4 ℃ 12000 g离心10 min （规范性附录）试剂配制 电泳缓冲液（50倍） A.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍) 羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯) 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8. 0) 100 mL 灭菌双蒸水 加至1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖（电泳级） 1g TAE电泳缓冲液(50倍)