5第五章基因克隆操作过程.ppt

第六章 基因克隆操作过程;基因克隆操作过程;切;一、DNA的体外重组（切与接）;1.DNA的体外重组（一）——切;*;*;单酶切实例（Takara）;双酶联合酶切实例（Takara）;2. DNA的体外重组（二）——接;2011-10-23;同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。 同尾酶一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。所有钝末端酶产生的末端均是相同的，但一般不作为同尾酶来研究。 同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同 基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大 ;;;（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接;基因克隆操作过程;CTGCA 3 ;C 3 ;;重组率;CTGCA 3 ;DNA ligase介导的体外连接实例（Takara）;二、重组DNA分子的转化和扩增 （转与增）;1.转化的原理与技术;2+;《分子克隆第三版》;Ca2+诱导转化过程中应注意的事项 转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%； 热击过程中不要摇晃离心管； 检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些（104菌落/板）；转化子于37℃培养不要超过20小时。因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现对Amp敏感的卫星菌落。 转化过程中37℃温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高，为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。 当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm，5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。 刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。;提高转化效率的几个重要因素： 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 　　;质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 ;试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制（过滤除菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4℃）。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, 枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。 ;2011-10-23;（3）λ噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30℃继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。 ;（4）电穿孔转化 原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。;（5）酵母的转化一般有以下两种方法： 利用酵母的原生质球进行转化 利用Li+盐进行转化 （6）植物细胞的转化及其他基因转移方法 叶盘法 电击法 基因枪法 （7）哺乳动物细胞基因导入法 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 显微注射法 DEAE葡聚糖转染技术 ;2.转化率; 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108 ，即每微克pUC18 中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4×1011个 分子，也就是说，每3400个pUC18分子中才有一个分子进入受体细胞。;（2）转化率的用途;（3）转化率的影响因素;3.转化细胞的扩增;三、转化子的筛选和鉴定（检）;1.载体遗传标记检测;Ap;（2）营养缺陷型筛选法;（3）显色筛选法;显色筛选法的基本操作：;2.克隆DNA序列检测;用BamHI酶切待鉴定