第二章基因工程的操作过程课件.ppt

A DNA的体外重组（切与连） B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 枯草芽孢杆菌感受态制备 挑取一新鲜培养的枯草芽孢杆菌单菌落接种于2.5 mL GMI培 养基中，30℃ 慢摇振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量 接种于2.5 mL新鲜的GMI中，37℃ 快摇振荡培养3.5 h；再将培养物 进行第二次传代，接种于5 mL GMII培养基中，突变型菌株以 10%接种量进行第二次传代，野生型菌株按5%接种量进行第二次传代， 37 ℃ 快速振荡培养90 min；取1 mL培养物， 5000 r/min室温离心5 min， 用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。 枯草芽孢杆菌质粒转化 取质粒加至感受态细胞悬液中，至终浓度1 μg/mL，质粒 体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37 ℃水浴 中静置30～60 min，37℃ 200 r/min振荡培养2～4 h，涂 合适的培养基上进行筛选，每100 μL转化体系涂一个平板 。 C 转化子的筛选和鉴定（检） C 转化子的筛选和鉴定（检） 转化率 转化率的影响因素 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化率 转化率的影响因素 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA 转化细胞的扩增 扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作 转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定 4 基因工程的操作过程 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 4 基因工程的操作过程 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 转化子 重组子 目的重组子 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r 抗药性筛选法的基本原理： pBR322 4363 bp ori 抗药性筛选法可区分转化子与非 转化子、重组子与非重组子 将外源DNA片段插在EcoRI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： 非重组子呈 Apr、Tcr 重组子呈 Apr、Tcs 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本操作： 先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至 含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不长的转化子即为 Ap Ap + Tc 影印 挑选 重组子 载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 常见的营养缺陷型筛选标记： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等 载体遗传标记检测 显色筛选法 显色筛选法的基本操作：