第九章液相色谱下13.ppt

液相色谱（三）Liquid chromatography 主要内容 亲和色谱（Affinity chromatography）(P163) 9.1 亲和分离技术(P164) 生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和分离技术. 亲和层析 1951年，Campbell等，半抗原修饰纤维素制备了生物亲和介质从血清中纯化了抗体。 1967年，Axen等利用溴化腈活化琼脂糖凝胶成功制备了亲和吸附介质，使亲和层析技术从研究走向实用。 其他新型亲和技术：亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀，亲和电泳等 配基（ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。 L+E?E·L 解离常数：Kd=[E][L]/[EL] 结合常数：Ka=1/Kd=[EL]/[E][L] 亲和配体(体系)分类(P164) 酶的抑制剂: 大豆胰蛋白酶抑制剂 抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析 A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。 凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。 辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。 三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。 过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸: 咪唑环，静电和疏水作用。 肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。与脂蛋白，脂肪酶、抗凝血酶等结合。 9.2 亲和色谱原理(P167) 　　亲和作用机理，特别是蛋白质亲和作用机理尚不清楚。目前的研究发现，亲和作用中存在构象及作用力两个方面的因素。 　　（1）蛋白质表面存在一些凹陷或凸起结构，上述结构恰好能使某些小分子进入到其中，形成构象上的“钥匙-锁”关系。 　　（2）亲和作用不仅依靠结构上相似性，还需要多种力的相互作用. 亲和作用中的相互作用力（补充掌握） 静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键 影响亲和作用的因素（补充掌握） 离子强度 pH 抑制氢键形成的物质 温度 螯合剂 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法 操作过程 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子 亲和配基固定化(不要求) 亲和配基的固定化方法 介质的活化 间隔臂的作用(掌握)(P175) 当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂” 间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱 亲和层析过程及影响因素 过程：进料→清洗→洗脱→介质再生 应保证配基对目标产物有较高的吸附容量。 目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用Freundlich或Langmuir型的等温式表示。 进料过程中的杂质影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。 进料的料液流速 　流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。 目标产物洗脱 特异性洗脱(P167亲和洗脱) 洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography） 利用抗体作为配基的亲和色谱。 Keq:107-1012L/mol 优点：高效 缺点：单抗昂贵；多抗特异性低 单抗免疫亲和色谱法纯化rhIFN-α 色素亲和色谱（dye-ligand affinity chromatography ） 利用色素作为配基的亲和色谱。 三嗪类色素(Triazine dyes)是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素(biomimetic dye)。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。 t-PA的纯化-酶的抑制剂为配基 固定化金属离子亲和层析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）(P177) 利用金属离子作为配基的亲和色谱。 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 首先要制备