采用人肿瘤类器官研究阻断Wnt信号治疗大肠癌可行性.docVIP

采用人肿瘤类器官研究阻断Wnt信号治疗大肠癌的可行性 　　[摘要] 目的 建立和优化大肠癌患者肿瘤类器官培养体系，为研究阻断Wnt信号治疗大肠癌提供新模型。 方法 选择大肠癌患者18例，收集癌组织及癌旁组织配对标本。采用定量PCR测定癌组织和癌旁组织Wnt3 mRNA和肠干细胞标记分子Lgr5、Ascl2的表达水平。术中采集肿瘤组织，使用类器官培养基培养肿瘤类器官。使用Wnt信号抑制剂IWP-2处理肿瘤类器官，观察IWP-2对肿瘤类器官形态、生长等的影响。 结果 定量PCR表明，与癌旁组织相比，肿瘤组织中的Wnt3表达水平较高[分别为（1.00±0.08）和（2.99±0.27），P 　　1.4 大肠癌肿瘤类器官立体培养 将含有大肠癌组织的溶液150 g，4°C 离心10 min，弃上清，再用基质胶（Matrigel，Basement Membrane Matrix）重悬[（200～500）个小组织块/50 μL Matrigel）]。将含有肿瘤组织的Matrigel滴于未加培养基的空白24孔板正中间，每孔50 μL。将24孔板放入37°C培养箱中。30 min后等Matrigel聚合成固态（Matrigel 4℃时为液态，室温下发生聚合而转变为固态），取出，加入含有多种生长因子的人类器官培养基（基础培养基组成：Advanced DMEM/F12，加入2 mM glutamine，10 mM HEPES，100 U/mL penicillin，100 g/mL streptomycin，2.5 μg/mL Fungizone，1×N2 supplement，1×B27 supplement。使用前添加：100 ng/mL Wnt3a，250 ng/mL R-spondin 1，100 ng/mL Noggin，50 ng/mL EGF，500 nM A-83-01，10 μM SB202190，10 nM[Leu]15-Gastrin 1， 1 mM N-Acetylcysteine 和10 mM Nicotinamide）。Matrigel购自BD Biosciences，培养基购自Invitrogen，生长因子购自PeproTech和R D 每2～3 d换液，大约1周后进行传代。传代时将培养板置于生物安全柜中冰盒上，吸去培养基。加入1 mL含预冷的PBS，反复吹打直至肉眼看不见块状胶体。转入15 mL离心管中，150G 离心5 min，弃上清。将细胞团用Matrigel重悬后，加到新的24孔培养板中。待Matrigel固化后，加入类器官培养基 1.5统计学方法 采用SPSS 19.0软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，对定量PCR数值进行t检验。P 　　大肠癌严重威胁着人类健康，其发生主要是因为肠道上皮细胞的功能异常。与细胞系相比，大肠癌类器官体外立体培养更接近人体内的真实情况。另外，体外培养体系相对简单可控，周期短，可大大加速相关研究的进展。本研究成功建立了大肠癌类器官培养体系。这一培养体系的建立对肠道干细胞和大肠癌研究的推动作用不言而喻 使用Wnt信号抑制剂IWP-2[15，16]，处理结肠肿瘤类器官，本研究进一步发现IWP-2可抑制大肠癌类器官的生长。由于抑制Wnt信号通路具有治疗结肠癌的潜能。本研究还尝试用Wnt信号抑制剂IWP-2处理结肠肿瘤类器官，本研究发现IWP-2可抑制大肠癌类器官的生长。本研究还设想通过大肠癌类器官培养体系为基础，高效筛选鉴别Wnt信号通路的小分子抑制剂，为研究大肠癌的发生机制、推动临床预防和治疗大肠癌提供证据 [参考文献] [1] Clevers H，Loh KM，Nusse R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration：Wnt signaling and stem cell control[J]. Science，2014，346（6205）：1248012. [2] Miyoshi H，Stappenbeck TS. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture[J]. Nat Protoc，2013，8（12）：2471-2482. [3] Harada N，Tamai Y，Ishikawa T，et al. Intestinal polyposis in mice with a dominant stable mutation of the beta-catenin