鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行.ppt

4）捕获活鼠脏器材料： 培养原则是单只培养，集组接种，每组 10只。 一般情况下只取肝、脾检验，每两只鼠脏器，分别培养于1个平皿上。按同一时间、同一地点捕获的同种动物培养后可分组进行动物试验，但每组一般不得超过10只，小型啮齿动物不得超过15只。 5）蚤、蜱等昆虫材料： 病死鼠体蚤均需单只检菌，将蚤体放入灭菌的凹玻璃板上，用生理盐水冼3次，将后胸背板和第一腹节剥开，用解剖针固定肛门前方，再用另一解剖针从头部刺入，拉出蚤胃，用灭菌白金耳在板上将胃磨破，接种于培养基上。 3 培养 鼠疫菌的最适培养温度为28℃，培养的动物材料连续观察3天，病死材料及蚤类材料连续观察5天，3天或5天不生长即可处理。 值得注意的是，野外实验室应随时观察孵箱温度的变化，始终保持在28~30℃之间。 4 结果观察 培养24～48小时后肉眼可见菌落形成，直径约0.1～0.2 mm,中央突起半透明淡灰色小菌落.镜下菌落中央呈黄褐色,有粗糙颗粒,边缘薄呈半透明有锯齿状花边。 将具有上述特点的菌落挑选出来进一步做鼠疫噬菌体试验。菌落观察必须仔细认真，肉眼初筛后，应勾画出可疑菌在镜下进一步观察确认，不得轻意丢弃。 Ⅲ 鼠疫噬菌体裂解试验 鼠疫噬菌体裂解试验是鼠疫细菌学诊断中较特异的诊断方法。 培养时发现的可疑菌落，用白金耳勾出移种在另一个琼脂平皿上，接种划线要密。然后用注射器滴加1滴鼠疫噬菌体于划线部位起点中心部分，合起平板并倾斜使噬菌体流线与培养划线垂直交叉流下，放入28℃温箱中，次日观察结果。如出现噬菌带则判为鼠疫噬菌体裂解试验阳性。即可判定为鼠疫菌。 一般做培养检查的同时做噬菌体裂解试验。即同时接种两个琼脂平皿，一个做培养检查，另一个做鼠疫噬菌体裂解试验。 操作中应注意以下几点： 1）疫噬菌体必须保持足够的效价（一般是10-8）效价降低到一定程度，则噬菌带不明显，噬菌体失效则不出现噬菌斑，造成错误的判断。 2）使用噬菌体前需观察有无污染，如有污染不得使用。 3）操作要规范，滴加噬菌体时，必须让噬菌体液自然流下。 4）真假阳性的区别： 阳性：噬菌带中间无鼠疫菌生长，噬菌带边缘在显微镜下有被侵噬的斑纹噬菌带逐渐扩展，扩展后两边有形象模糊的边缘。 假阳性：噬菌体流道中间有与培养菌相同的菌落，流道边缘菌落或菌苔完整，由于细菌生长，流道逐渐缩小或不明显 。 Ⅳ 动物试验 动物试验在鼠疫细菌学检查中有2种目的。一种目的是材料含菌量少或材料腐败，培养不易获得阳性结果时，以敏感动物体培养，同时也为了观察细菌对动物的致病性和病理变化；另一种目的是菌株已经分离出来，为了测定该菌株毒力的强弱，或者为了增强菌株的毒力，而作动物试验。 试验动物常用小白鼠（18-20g）和豚鼠（250-300g），而以豚鼠最好，因小白鼠对鼠疫菌的毒素较敏感且在夏季死亡后极易腐败，分离鼠疫菌较困难。 1 被检悬液的制备： （1）脏器：将所取脏器块放入已消毒好的乳钵中剪碎研磨后，按1:10的比例加入生理盐水，为了便于注射器吸取脏器悬液，可在脏器悬液中加一小块灭菌脱脂棉。 （2）昆虫：将已分类好的蚤、蜱从保存液取出，用灭菌盐水反复冲洗数次，然后研磨制成悬液，接种动物；当检获大量蚤类时，可按地区、宿主、蚤种进行分组，每组30只。 2 接种方法： 根据不同目的、被检材料新鲜及腐败程度来决定接种方法。 （1）腹腔接种：一般新鲜材料和纯培养的菌液，为了迅速获取阳性结果而又不期待它出现较完全的病理变化时多用腹腔接种。 将腹部皮肤注射部位剪毛，经消毒后提起腹部，将被检悬液注入腹腔，注意不得损伤内脏器官。接种量为小白鼠每只0.2～0.4ml，豚鼠每只接种0.5～0.6ml。 （2）经皮接种：这种方法多用于腐败或污染程度严重的材料。将小白鼠或豚鼠腹部毛剪去一小块，用刀刮至有出血点后，将待检材料以棉拭子涂布于已刮过的皮上并反复揉擦，使液体充分浸入。 （3）皮下接种：材料不太腐败时此方法较好，一般病程短，病理变化较明显。是动物接种最常用的方法。 试验动物鼠蹊部经消毒后将被检悬液注入皮下，接种剂量同腹腔接种法。 一般每份材料接种两只小白鼠，按材料的新鲜与腐败的不同程度常采取两种不同途径进行接种。如材料新鲜可采用皮下、腹腔各一只，如果材料腐败，则可采取皮下、经皮各接种一只。