iPSC移植替代治疗巨结肠前期研究的现状与思考.docVIP

iPSC移植替代治疗巨结肠前期研究的现状与思考 先天性巨结肠(Hirschsprung disease，HSCR)是儿童常见的消化道畸形，虽病因复杂，但病理过程已形成共识：在原肠发育过程中，外胚层神经嵴细胞(Neural crest cell, NCC)增生和移行过程停顿，致使肠壁肌间神经丛和黏膜下神经丛内神经节细胞缺如，肠管失去正常蠕动，粪便排出障碍，病变近端肠管异常扩张、肥厚所致[1]。NCC发生于胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)，它不仅是肠道系统的神经干细胞，也是神经节细胞的前体细胞[2]。人类已迈入干细胞时代，干细胞替代技术已成为许多疾病的重要治疗手段，例如，造血干细胞、神经干细胞和心肌干细胞等已成功应用于血液肿瘤、帕金森病，及心肌梗死的治疗，并取得了满意疗效[3-]。人们也曾探索采用ESC移植替代治疗HSCR，但由于技术等因素的制约，总体工作进展缓慢。 近年来国外学者采用细胞重编程方法已成功获取诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells: iPSC)，在形态和功能上iPSC与ESC极为相似，经诱导后可向成体干细胞和体细胞分化。作为干细胞领域内的一次变革，iPSC不但突破了免疫排斥和伦理学限制，也提供了新的干细胞选择，是当前干细胞移植替代治疗HSCR的研究热点。 一、iPSC简介 2006年日本学者Shinya Yamanaka采用病毒载体将4个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)复合体导入鼠尾皮肤成纤维细胞对其重编程，并在ESC培养基中加入相应小分子物质促进重编程，细胞经诱导后分化为iPSC，且该iPSC是一种类似ESC的干细胞 (图)，可表达ESC特异性细胞标志；将iPSC注入先天免疫缺陷裸鼠皮下，观察到包含三胚层细胞的畸胎瘤，进一步证明iPSC具有ESC分化潜能，二者在形态、表观遗传修饰状态、基因和蛋白表达、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力，以及分化能力等方面均极为相似[]。2007年他们宣布该研究在人体皮肤细胞上也获得成功[]。iPSC研究不仅颠覆了“分化成熟的体细胞不能向干细胞转化”这一观点，更重要的是：它为细胞生物学、表观遗传学、发育生物学和干细胞应用研究，以及再生医学研究开辟了新的道路。在临床研究方面：iPSC获取简单，避免了对ESC的依赖和道德伦理等问题；采用病人体细胞制备“病人特异性iPSC”，避免了免疫排斥问题；在干细胞替代治疗、遗传异常和发育机制研究，及新药筛选等方面优势明显。 截至目前，iPSC已被分化为神经元和神经胶质细胞[]、心血管细胞[]，及原始生殖细胞等[]，并成功应用于神经和心血管系统疾病的前期治疗。由于其获取简单，操作方便、与ESC性状极为相似、分化潜能和多能性明显，经诱导后可向多种多能/单能干细胞和体细胞分化，iPSC在生物医学各分支领域应用前景广阔。Shinya Yamanaka与英国学者John B. Gurdon也因此获得2012年诺贝尔生理学和医学奖。 二、iPSC分化诱导NCC构建背景研究 HSCR是肠道神经系统(enteric nervous system, ENS) 先天发育异常的结果。ENS是肠壁内相对独立的神经调节网络，作为肠道袖珍大脑，能有效调节消化道的吸收、分泌和节律性运动，而ENS起源于NCC：神经管内NCC→增生、移行至胚肠间质→成为肠道NCC→沿胚肠增殖、迁徙和定植→经不对称分裂，产生自身细胞和子代细胞→最终分化出各种终末细胞(神经元，胶质细胞和聚集后的神经节细胞)→形成神经网络，构成ENS。对小鼠研究证实：胚胎9—9.5天时(人类发生于妊娠4周后)，迷走NCC(以及少量躯干NCC)进入消化管，沿头尾方向连续迁移定植于前肠(食道、胃和十二指肠)，中肠(小肠、盲肠、阑尾、升结肠和近端横结肠)，以及后肠(远端横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)，这一过程到胚胎15天完成(人类于妊娠7周后完成)。此外，适当的NCC数量也对正常定植具有重要意义。因此，不难理解：发育过程中各种原因导致的NCC增生移行停顿，即可造成ENS发育异常，且停顿的时间越早，则病变的部位越长，从而形成不同临床类型的HSCR (图)。由于直肠、乙状结肠位于消化道最远端，所以受累的机会最多(约85％)。 图. iPSC体外诱导分化示意图图. NCC增生移行紊乱可形成不同类型的HSCR (黑点示肠NCC数量和分布) 人们已采用NCC植入法使其在病变部位重新分化形成肠道神经元，重建无神经节细胞肠段内的ENS，实现了治愈HSCR的目的。有学者从胚胎和新生小鼠肠管内提取肠NCC，植入体外培养的小鼠无神经节细胞胚胎肠管组织后，肠NCC可定植并分化为神经元和神经胶质细胞，移植后肠管功能部分恢复[1-12]。尽管如此存在较多技