项目一 核酸的生产.ppt

项目一 核酸的生产 第一章 概述 由来：首先在细胞核中被发现的，呈酸性，即称为核酸。 分类： １.脱氧核糖核酸(DNA)是生物遗传变异的基础。 ２.核糖核酸(RNA)参与体内蛋白质生物合成过程，主要包括：tRNA（转运氨基酸的作用）、mRNA（模板作用）、rRNA（作为场所，车间） 核酸的分布： １.DNA主要分布在细胞核内，线粒体和叶绿体内也含有少量DNA。 ２.RNA主要分布在细胞质（主）、细胞核（少）中。 ３.对于病毒来说，只能含有RNA或DNA中的一种，据此可将病毒分为RNA病毒或DNA病毒两类。 细胞核里的RNA称为核不均一RNA。 核酸的化学组成 1.核酸的元素组成：组成核酸的主要元素有：C、H、O、N、P等，其中P的含量最大，约占总量的9%~10%。 2.核酸的基本组成单位：核苷酸（单核苷酸） RNA和DNA都是以单核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链，核苷酸是由戊糖、磷酸和含氮碱基三类成分构成的。 1.一般性质（核酸的分子大小、形状、黏度、溶解度） 2.核酸的酸碱性 3.核酸的变性、复性和分子杂交： 4.核酸杂交： 核酸的物理化学性质 核酸的水解产物： 核酸 核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 核糖 脱氧核糖 含氮碱 嘌呤碱 嘧啶碱 核酸的生理功能 基因的核苷酸序列决定了蛋白质的氨基酸序列，同时核酸还可自我复制传递给子代，因此在每个生物体中，核酸是遗传信息的载体和各种生命活动信息指令的根本来源。 中心法则： 第二章 核酸的制备和应用 制备途径及选择材料 ： 有三种途径，分别是从生物组织中直接分离提取、选育高产核酸类物质的微生物菌种通过发酵法制得、化学合成。应用较多的主要是前两种。大多数核酸在细胞中是以蛋白质结合的状态存在，因此在制备核酸时要将它雨蛋白质分离开。 选材： 选用生长较旺盛的组织，如胰、脾、胸腺等，这类组织比同样体积的其他组织，如肌肉等组织含有更多的细胞数，核酸的含量较高。 核酸制备的基本步骤 破碎细胞 提取 纯化 核酸分离纯化的一般原则 1.保持核酸分子一级结构的完整性，是核酸结构与功能的最基本要求。 2.排除其他分子的污染，保证核酸的纯度。 核酸的提取、分离纯化 从动植物组织和微生物中提取核酸一般原则是首先要破碎细胞，提取核蛋白，然后把核酸和蛋白质分离，再沉淀核酸进行纯化。 核酸属于大分子化合物，具有复杂的空间三维结构，为了使得到的核酸保持天然状态，在提取分离是要注意避免强酸、强碱对核酸的降解，避免高温、机械剪切力对核酸空间结构的破坏，操作时在溶液空间中加入核酸酶抑制剂，整个操作过程要在低温（0°C左右）条件下进行，同时还要注意避免剧烈的搅拌。 包括：1）核蛋白的提取 2）核蛋白中蛋白质的去除 3）核酸的分离纯化 核酸含量的测定方法及原理 1．紫外分光光度法 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收高峰在260nm波长处。一般在260波长下，每1毫升含1μgRNA溶液的光吸收值为0.022，每1毫升含1μgDNA溶液的光吸收值约0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简单、迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。 2.定磷法 核酸分子结构含有一定比例的磷（RNA的含磷量约8.5%~9.0%，DNA含磷量约9.2%）测定其含磷量即可求出核酸的量。 核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下，无机磷与钼酸铵结合成黄色磷钼酸铵沉淀，当有还原剂存在时，Mo从+6被还原为+4价，+4价的Mo再与试剂中的其他MoO4结合成Mo(MoO)2或Mo3O8,呈蓝黑色，称为钼蓝。 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可用比色法测定。若样品中尚含有无机磷，需做对照测定，消除无机磷的影响，以提高准确性。 3．定糖法 （1）地衣酚显色法测定RNA含量: RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3,5—二羟基甲苯（地衣酚，苔黑酚）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收值。当RNA浓度为20~250μg/ml时，光密度与RNA度成正比。 （2）二苯胺法测定DNA含量 DNA分子中有2—脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2—脱氧核糖并形成ω－羟基－?－酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40~400μg范围内时，光密度