修改第7章制备色谱分离技术.ppt

模拟移动床色谱应用 工业手性药物大规模拆 第六节 亲和色谱分离技术 亲和色谱法：利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种色谱方法。 如抗原与抗体，酶与底物，激素与受体等 广泛用于酶、抗体、核酸、激素等的分离与纯化，特别是对含量极少而又不稳定的活性物质最有效。 一、基本原理 亲和色谱是应用生物分子对它的互补结合体（配基）的生物识别能力，使目标产物得以分离纯化的液相层析法。 配基的固定化 吸附样品 样品解析（洗脱） 具有亲和力的两个分子中的一个（配基）以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂 样品（流动相）流经层析柱时，配基选择性吸附目的分子，杂质不能被吸附而流出。 选择适宜的条件将被吸附的目的分子洗脱 配基 载体 亲和层析 亲和物 杂质 + 洗涤 洗脱 再生 二、载体的选择 ① 载体为不溶性的多孔网状结构及良好的渗透性。 ② 载体必须具有较高的物理化学稳定性、生物惰性及机械强度。 ③ 载体必须具有亲水性和水不溶性，无非特异性吸附。 ④ 含有可活化的反应基团，有利于亲和配基的固定化。 ⑤ 能够抵抗微生物和酶的侵蚀。 三、配基的选择 ① 特殊配基：抗原的抗体，酶的专一抑制剂，激素的受体 ② 通用配基：可适于一类物质的分离提纯。 一个理想的配基应具有以下性质 配基与配体的亲和具有专一性。 配体与培基之间有足够的亲和力，但两者的结合也应具有一定的可逆性。 配基的大小合适。 配基必须具有适当的化学基团。 四、操作方法 具有亲和力的一对分子中的一个作为配基，与不溶性载体结合，使之固化，装入色谱柱 含目的物的混合液作为流动相进入色谱柱，配基选择性吸附目的物质，杂质不能被吸附而直接流出。 改变条件使配基与其亲和物解离 亲和层析的基本过程： * * 厚朴 Hòu Pò 2. 中压色谱技术 中压色谱柱大多是由耐压的强化玻璃制成，多数情况下，中压色谱柱需由实验人员自己填装。可采用湿法或干法装柱。 在实际工作中，中压制备色谱既可利用制备色谱仪来完成，也可根据研究需要由自己来组装，其部件主要有：能提供几十公斤压力的横流泵、色谱柱、检测器，而对于较完备的色谱装置还配有自动分馏收集器和进样阀。 对于复杂的中药提取物中有效成分的分离，在进行中压色谱柱分离之前需进行预处理，如大空树脂处理、萃取等。 填装好色谱柱后，将填装好的色谱柱进行减压或氮气加压，以便将色谱柱压紧。干法装柱可使固定相填装密度至少提高20％。 表6-6 中压制备色谱在各种天然药物分离中的应用 分离物质 柱尺寸/mm 填料 流动相 吲哚生物碱 713×18.5 RP-18（40μm） 甲醇-乙睛-四氢呋喃-水 生物碱糖苷 100×10 RP-18（40～63μm） 乙睛-水（24:76） 色酮 460×26 Diod 己烷-乙酸乙酯（4:1） 单萜 460×36 RP-18（15～25μm） 甲醇-水（65:35） 三萜 460×50 SiO（35～70μm） 二氯甲烷-甲醇-乙酸（110:8:3） 3. 高压制备液相色谱 高压制备液相色谱具有柱效高、分离速度快等特点。 与分析型制备色谱相比，其通量是分析型的几百倍上千倍，制备型选用的是大流速的泵（数十毫升/min甚至上百毫升/min），5μm以上的粗粒径填料，实验室用制备柱的粒径一般为5～20μm。色谱柱较分析型粗（分析型色谱柱的内径一般为4～5mm），一般φ8～22mm，以提高柱子的载样量。 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）。 (1) 液液色谱-----正相色谱法 　采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。? 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计占整个HPLC应用的80%左右。 C18和C8使用的pH值通常为2.5～7.5，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 C18和C8使用的pH值通常为2.5～7.5，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 （2）离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。 它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物