2.2 基因工程载体-噬菌体载体 201209知识.ppt

第二节 噬菌体载体 2012.09 一、?噬菌体载体 λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（lytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解 。 ?噬菌体 ◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。 二、单链噬菌体载体 3. M13噬菌体 （一）粘粒(cosmid) 3 PCR产物克隆载体 T 载体 pCR系列载体 Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。 ① 结构 pUC的质粒部分、fi噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。 MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。 ② 特点 PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。 T vector的克隆过程——简便！ A A T T T vector PCR product T4 DNA ligase A A 四、柯斯质粒载体 （五）λ-DNA作为载体的优点 体外包装病毒颗粒，高效感染E.coli 2) 装载外源能力为25kb，大于质粒 3) 筛选方便 4) 重组λ-DNA分子提取容易 （一）单链噬菌体载体 M13、f1、fd 噬菌体 单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13 噬菌体 单链DNA噬菌体载体 M13、f1、fd。 优越性： 1. 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多制约的，不存在包装限制 问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。 噬菌体 正链 复制 复制型 DNA 经pII蛋白 造缺口 3′ 5′ 经pII 蛋白 剪切 释出单链DNA(正链) 进入下 一循环 5′ 3′ 3′ 5′ 滚环复制 在细菌内的复制模式图 M13噬菌体几个重要特点： 1. M13噬菌体不溶解宿主细胞，只是降 低宿主细胞的生长速度。 2. M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。 3. 克隆的外源基因片段不宜大于1000bp。 M13噬菌体载体  M13是一种含单键（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。 M13噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。 成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论是RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。 噬菌体颗粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制约的，这一点正好与λ噬菌体相反。所以M13噬菌体并不存在包装限制的问题。 M13单链DNA噬菌体的生命周期 RF DNA Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII ± RF Nicked by gene 2 protein + ss-Rolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phagereleased from the cell. （二） M13载体的构建 （1）克隆区域的选定 ① 基因间隔区（intergenic region, IG区） J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）