生化实验05凯氏定氮法-2.pptVIP

Designed by XK Wang * 实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法） * 氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定意义。 动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。 组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。 * 一、原理 在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。 * 一、原理 以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO4→2CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 →(NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH →2H2O + Na2SO4 + 2NH3↑ 2NH3 + 4H3BO3 →(NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3 * 材料：面粉仪器设备：消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。试剂： 1. 浓硫酸（AR级）；2. 30%（W/V）NaOH； 3. 30%H2O2； 4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 5. 2%硼酸溶液； 6. 混合催化剂； 7. 混合指示剂（pH变化范围） 二、材料、仪器设备及试剂 * 凯氏定氮蒸馏装置 全自动凯氏定氮仪 * 三、实验步骤 1. 样品消化（已完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。 在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管，用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在通风橱中进行。 * 2. 定容： 消化液冷却后，沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁→冷却后转入100mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度，混匀后备用。 3. 蒸馏（1）仪器洗涤：在蒸汽发生器中加入2/3体积蒸馏水→关闭汽水分离器阀和进样漏斗、并使管道联通→打开冷凝管→打开电炉加热蒸汽发生器，用热蒸汽通入仪器各部分清洗15min。 蒸汽 发生器 安全管 反应管 隔热套 冷凝管 吸收瓶 导管 汽水分离器 进样漏斗 密封阀 * 3. 蒸馏（1）仪器洗涤 冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏管加入无氨蒸馏水，清洗蒸馏反应管→打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被虹吸进入隔热套中→打开隔热套下端的活塞阀排出废液。如此清洗2-3次。 可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果，当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净 。 * 3. 蒸馏 （2）样品蒸馏 在三角瓶中装入20mL硼酸-指示剂混合液（此时应为紫红色，如变为蓝色，应倒出重装或清洗三角瓶）承接在冷凝管下端出口，将出口浸入在溶液中→打开汽水分离阀隔活塞,打开蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管夹→准确吸取10mL样品消化液通过加样漏斗加入蒸馏瓶中→通过漏斗加入10mL NaOH溶液→用少量无氨蒸馏水重复冲洗漏斗3次→塞紧漏斗塞，再在漏斗中加入少量蒸馏水密封漏斗→关闭汽水分离阀，开始蒸馏→观察硼酸-指示剂混合液颜色变化，从颜色变绿起再蒸馏3-5min后，将三角瓶液面移离冷凝管下口约1cm → 继续蒸馏1min左右，结束蒸馏。 * 3. 蒸馏 （3）空白蒸馏 用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进行蒸馏。4.