第5章基因工程的主要技术及其原理.ppt

第5章 基因工程的主要技术及其原理 5.1 DNA和RNA的提取和纯化 1.DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂 DNA多以DNP（脱氧核糖核蛋白）形式存在 DNP在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度最低，随盐浓度的增加溶解度增加。 RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度较大，常用此法分离DNP和RNP 主要步骤： 细胞裂解和DNA的溶解 注意灭活细胞内的DNA酶，防止DNA被酶解 除去蛋白质和RNA等杂质 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）可溶解细胞膜，同时使蛋白变性 CTAB与DNA形成复合物，高盐可溶，低盐沉淀，可将DNA与蛋白质、多糖分开 SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性,释放出核酸 氯仿、苯酚使蛋白变性，通过离心蛋白质被沉降到酚相与水相的界面，而DNA留在水相 必要时加入RNA酶除去RNA杂质。 DNA的沉淀和纯化 处在上清液中的DNA可用2倍体积无水乙醇沉淀 但在多糖、蛋白含量高时，可用2／3体积的异丙醇沉淀 70-75%的乙醇清洗各种离子 2.DNA提取的几种方法 1）浓盐法： 利用RNA和DNA的溶解度不同将二者分离。 通常用5MNaCl、0.015M 柠檬酸钠 （SSC溶液） 柠檬酸钠作为金属离子络合剂，钝化DNase。 2）SDS法 细胞破碎后，SDS使细胞膜裂解，同时使蛋白质变性，将蛋白质、多糖等杂质与DNA分开 ，加入乙酸钾使SDS-蛋白质 复合物转变成溶解度更小的钾盐，使沉淀更加完全。 3）CTAB法 快捷简便的提取植物等生物总DNA的方法 细胞破碎后，加入CTAB缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后可得到DNA 4）苯酚抽提法 用苯酚处理匀浆液，蛋白质处于酚相，而DNA溶于水相，离心分离水相，再用乙醇沉淀。 1)取1.5 mL菌液离心，收集菌体。弃上清，加入1 mL TE buffer洗涤菌体。 2)离心弃上清，加入567 μL TE打散菌体后，加50 μl溶菌酶，37℃ 水浴2 h。 3)再加入30 μL SDS（10%）和3 μL蛋白酶K颠倒混匀，置37℃温育1 h。 4)温育结束后，加100 μL 5 mol/L NaCl 充分混匀，再加80 μL的CTAB/NaCl 混匀；置70℃ 水浴10 min。 5)加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混匀，12000 r/min离心5 min。将上清转移到干净离心管中，要尽量动作轻柔，避免将蛋白质吸上来。 6)在上清中加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇（25：24：1）溶液，轻轻颠倒混匀后12000 r/min离心5min， 7)上清液中加入2/3体积异丙醇，颠倒混匀后，4℃下12000r/min离心10min。 8)缓缓倒去溶液，加入600μL 70% 乙醇洗涤，12000 r/min离心5min。 9)倒去溶液，待沉淀干燥后，加入40 μL TE溶液或灭菌去离子水重悬DNA，放-20℃冰箱保存备用。 3.质粒的抽提(碱变性法） 又称碱裂解法，是一种最广泛的制备质粒 DNA的方法，此法是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。 在 pH高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。 当以 pH4.8 的 KAc 高盐缓冲液调节起 pH 至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 1.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl (pH 8.0)， 10mM EDTA (pH 8.0）。 2. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH， 1% SDS。 3. 溶液Ⅲ：3M KAc缓冲液，pH 4.8。 （1）收集1.5ml菌液到1.5ml 离心管中，12000rpm离心1min。弃上清，收集菌体。 （2）再加入100 μL的溶液Ⅰ，剧烈振荡打散菌体，使菌体分散混匀，加入200 μL的溶液Ⅱ轻轻颠倒混和均匀（注意：动作一定要轻，不可剧烈颠倒！），放置5min左右，加入150 μL的溶液Ⅲ混和均匀，12000rpm离心5 min。 （3）取上清液加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，充分混匀后室温12000 rpm离心5 min，取上层水相至另一干净的EP管中。 （4）离心结束后，将上清转移至一干净离心管中，再加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，置