第三章基因工程中常用的酶查笑君.pptVIP

基因工程中常用的酶 一、限制性核酸内切酶 二、连接酶 三、聚合酶 四、修饰酶 基因的剪刀 ----------------限制性内切酶 核酸酶（P41-42)：切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶。可分为核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶。 按水解断裂核酸分子的不同方式分： 核酸外切酶：以核酸的末端为酶解部位逐个降解核苷酸 核酸内切酶：从核酸内部水解磷酸二酯键使之断裂 限制性核酸内 切酶，简称限制酶 一. 限制与修饰发展史: 1962年 Arber, W. (瑞士) 等 提出限制与修饰假说。 1968 Meselson和Yuan 发现Ⅰ型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox 发现了Ⅱ类限制性酶并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年度诺贝尔生理学和医学奖。 1962 , Arber, 1968 Smith等发现限制性酶 二.限制性内切酶的类型（P44） 二. Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式： 限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 G↓AATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCA↓G BseⅡ Bacilus stearothermophilus strain 822 (HpaⅠ) GTT↓AAC EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序) Cla Ⅰ Nco Ⅰ Nde Ⅰ Not Ⅰ Sac Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ Ⅱ型内切酶识别位点序列中心对称 酶切位点及酶切未端 平未端 EcoR Ⅴ (5’ ··· GAT^ ATC ··· 3’) Hinc Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Hind Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Sca Ⅰ (5’ ··· AGT ^ ACT ··· 3’) Sma Ⅰ (5’ ··· CCC ^ GGG ··· 3’) 具5‘突出未端的粘性未端 BamH Ⅰ (5’ ··· G ^ GATCC ··· 3’) EcoR Ⅰ (5’ ··· G ^ AATTC ··· 3’) Hind Ⅲ (5’ ··· A ^ AGCTT ··· 3’) Nco Ⅰ (5’ ··· C ^ CATGG ··· 3’) Nde Ⅰ (5’ ··· CA ^ TATG ··· 3’) Not Ⅰ (5’ ··· GC^ GGCCGC ··· 3’) SalⅠ (5’ ··· G^ TCGAC ··· 3’) XbaⅠ (5’ ··· T^ CTAGA ··· 3’) XhoⅠ (5’ ··· C^ TCGAG ··· 3’) KpnⅠ (5’ ··· GGTAC^ C ··· 3’) PstⅠ (5’ ··· CTGCA^ G ··· 3’) SacⅠ (5’ ··· GAGCT^ C ··· 3’) 同裂酶 识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶称为同裂酶 Hinc Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Hind Ⅱ(5’ ··· GT(T/C) ^ (A/G)AC ··· 3’) Sma Ⅰ (5’ ··· CCC ^ GGG ··· 3’) Xma Ⅰ (5’ ··· C ^ CCGGG ··· 3’) 三、限制酶的识别序列与DNA的切割（P47） 1、限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性； 2、限制酶识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可以从理论上推导酶切DNA片段的大小； 作用于同一种DNA分子，识别序列短的出现概率大，酶切DNA片段小。 识别位点： 4个碱基：44 = 256 　　　　　　 6个碱基：46 = 4096 　　 3、限制酶识别序列的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个核苷酸才能被有效酶切。 应用：设计引物时加保护碱基。 4、限制酶的位点偏爱性(p48):限制性核酸酶的切割效率与酶切位点侧翼序列的核苷酸组成有关。 这是一些限制性内切酶酶切效率不高的原因。例如：在实验过程中，经常会发现HindIII、XbaI等酶活性较低。 应用