离子交换及亲及层析.pdfVIP

4、等电聚焦电泳 4、等电聚焦电泳 （1）基本原理 （1）基本原理 等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解 质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。当蛋白质放进此体系时， 靠近阳极侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的蛋 白质处于碱性环境中，带负电荷向正极移动，最终都聚焦于与其等电点相当 的pH位置上，形成不同的蛋白质区带。 (2) pH梯度的建立。 (2) pH梯度的建立。 人工pH梯度：用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度。 天然pH梯度：利用载体两性电解质（carrier ampholytes ）在电场作用下自 然形成pH梯度。该方法是常用的方法 低pH + H SO 2 4 两性电解质(带正电) 一些pK和pI值各自相异却又 相近的两性电解质 甲(酸性很强) 高pH 乙(等电点稍高于甲) 两性电解质(带负电) NaOH − − 载体两性电解质应具备的条件： 载体两性电解质应具备的条件： ① 在等电点处必须有足够的缓冲能力 ② 在等电点必须有足够高的电导 ③ 分子量要小 ④ 化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定； ⑤ 应不与分离物质反应或使之变性。 聚丙烯酰胺凝胶 最广泛 等电聚焦的支持介质 等电聚焦的支持介质 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 （3 ）等电聚焦电泳的方式 （3 ）等电聚焦电泳的方式 垂直管式 毛细管式 分析样品多 水平板式 超薄水平板式 两性电解质用量少 结果重复性好 （4 ）优点 （4 ）优点 ① 有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02 pH单位的蛋白质分开； ② 能抵消扩散作用，使区带越走越窄。一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时 间和泳动距离加长，区带越走越宽 ③ 很稀的样品也可进行分离. 由于这种等电聚焦作用，不管样品加在什么部位， 都可聚焦到其等电点位置. ④ 可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01 pH单位。 （5 ）缺点 （5 ）缺点 ① 要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀 ② 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 5、离子交换层析 5、离子交换层析 优点： 优点 ①具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大； 2有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋 白质变性或酶的失活； 3多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。 （1）基本原理 （1）基本原理 基质 离子交换剂是由 电荷基团（或功能基团） 反离子