设计RT-PCR引物方法课件.docx

设计RT-PCR引物方法要鉴定某一个基因在mRNA水平上的表达，需要使用Q-PCR的方法。引物设计是很重要的一环，要进行Q-PCR时，获得引物的途径有很多种，其中最为方便的是使用NCBI和primer bank，首先介绍这一方法：比如你要检测某药物对小鼠细胞中IL-2的表达影响，通过Q-PCR检测，要设计引物。登陆NCBI，选择gene，在选框中输入 IL-2 mus（搜索小鼠IL-2基因）点击搜索获得结果如下：选择第一个基因，打开，可以获得gene的ID利用primer bank和ncbi的gene ID就可以获得前人已经设计好的引物登陆primer bank （/primerbank/），按下图选择NCBI gene ID 选择物种 mouse ，在 for text中输入前面获得的你要检测基因的ID（NCBI的编号）点击submit 查询，获得如下结果可以看到其它人设计的好几对引物，基本上是通过实验验证的，做Q-PCR的话直接拿来用就行了，点击绿色高亮的链接可以看到其他人使用这对引物做Q-PCR获得的结果。二、自己设计Q-PCR引物方法比如要检测CXCR3的表达，做Q-PCR的扩增目的条带在100bp左右，如果半定量的话（通过跑胶定量）扩增产物一般400bp左右登陆NCBI，选择gene，在选框中输入CXCR3 mus（搜索小鼠CXCR3基因）点击搜索点击打开将网页往下拖到NCBI reference sequence 选择箭头所示mRNA序列打开链接往网页下方拖动，可以看到CDS，点击CDS（编码蛋白区）出现如下界面，高亮部分为CDS去ATG起始密码子TAA终止密码子复制CDS区及其附近部分序列，如果要提取基因的话需要完全包括CDS区，如果只是检测的话，比如半定量的话就没必要全部包括。打开primer 5 软件，新建一个DNA序列将复制的序列粘贴到选项框中，点击oK序列就导入了primer 5中，然后单击箭头所指primer，进入引物设计界面界面如下，点击search，使用primer自动寻找引物功能进入界面后，分别按下图选取所需要的参数，PCR product size使用默认值即可，primer length一般在20bp左右比较合适点击OK后进入如下界面，点击OK出现如下界面，点击rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物越好，根据自己试验目的，选择打分高的，产物片段400bp左右的引物对，并且Tm温度最好在60以上，有义链和反义链Tm值靠的越近越好，最好不要超过2摄氏度，下图中Tm行中蓝色字体表示有义链的Tm值，红色字体表示反义链Tm值，PCR退火温度一般设置比Tm值低5摄氏度。我选择的是排行第四的引物对，单击选择后在，引物设计窗口，我们可以看到这对引物的具体情况，下图中红色箭头指的S和A分别指的是有义链和反义链，点击edit primers可以复制编辑引物选择引物序列，复制到word文档中作为正向引物点击ok后回到primer 界面后点击A，然后点击Edit primers获得反向引物序列下面是我获得的引物序列因为做半定量的模板是整个小鼠基因组，这就需要使用primer-blast验证引物的特异性（是否不会扩增出其它的基因）进入primer-blast网站(/tools/primer-blast/)在primer parameters中输入前面设计的正向引物和反向引物在primer pair specificity checking中选择database为refseq mRNA ，organism中输入mouse后选择mouse最后选择如下，选择在新窗口中显示结果，点击get primer。最后出现如下结果，反馈的结果中就只有一个基因　CXCR3，就是我要检测的基因，证明这对引物的特异性不错，可以用于实验。并不是选择的每一对引物通过blast后就只有一个基因，很多情况下回出现不是只有一个基因的情况，情况如下图，那就需要再次设计，然后检验，直到获得特异的结果。获得特异性结果后，可以使用oligo7对所设计的引物进行评价，另外使用primer5的设计的引物在很多情况下总是特异性不是很好，也可以使用oligo7设计引物，oligo7设计的引物特异性会好一些。使用oligo 7设计引物新建一个序列将mRNA的序列粘贴到新建对话框中，选择acceptclose选择search for primers probes分别单击paremeters和ranges在parameters中根据图所示选择引物长度（一般在20bp左右）在ranges中选择PCR产物的长度范围和设计引物的范围单击search后出现引物对选择selected oligonucleotides单击选择评分最高的引物，然后选择edit中forw