人类基因组计划DNA提取剖析.pptx

人类基因组计划DNA提取 方法 DNA提取的实验步骤 （一）材料与设备 1.试剂：消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS， 0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇； 95% 乙醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS； 2.仪器：培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头；离心机、液氮罐、组 织匀浆器、恒温培养箱。 Tris 中文名：三羟甲基氨基甲烷； 性状：白色结晶 水溶液无色，澄清； 作用：作为核酸和蛋白质的溶剂。 Tris-Hcl缓冲液由Tris和Hcl混合而成。 EDTA中文名：乙二胺四乙酸； 性状：白色粉末，能溶于氢氧化钠、碳酸钠及氨溶液中，能溶于160分沸水，微溶于冷水，溶 于乙醇、丙酮及部分有机溶剂； 作用：用于排除大部分过度金属元素离子（如铁，镍，锰）的干扰。 SDS中文名：十二烷基硫酸钠 ； 性 状：白色或浅黄色结晶或粉末。有特殊气味。在湿热空气中分解。易溶于水，溶于热醇； 作用：在DNA提取中，高浓度的阴离子去垢剂 SDS使DNA 与蛋白质分离。 PBS中文名：磷酸盐缓冲溶液，一般选择Na2HPO4和KH2PO4配制； 作用：PBS一般用作支持电解质。 tes饱和酚作用：将DNA层与变性蛋白质层分离。 氯仿 性状：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味； 作用：与异戊醇混合以抽提DNA。 异戊醇性状：无色液体，有令人不愉快的气味； 作用：与氯仿混合抽提DNA。 乙醇 作用：促使DNA沉淀。 TE缓冲液：由Tris和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA （二）主要步骤 1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组 织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl， pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。 2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞， 弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞， 500g×5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。 3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。 4.冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。 5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。 6. 4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变 性蛋白层。 7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层 8. DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。 9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。 10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。 11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。 12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。 13.用75%冷乙醇清洗3～4次。 14.室温干燥或冷冻干燥DNA。 15.加适量TE溶液溶解DNA。