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重组干扰素课件
;;;;干扰素的作用机制;;关于乙肝;干扰素的分类及应用;;资金来源多样化;;;;;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;构建与保藏;;;PEG分子量;1989-1999年,多亚型人天然干扰素混合物——IFNα-N3 和IFNα-N1 获批上市。由于人天然干扰素因其产量低、活性低且具有潜在的血源性病毒污染等特点而逐渐退出市场。
1987年,Amgen公司生产的复合干扰素产品Infergen(重组集成干扰素α注射液)获批上市,主要用于成年患者的慢性丙型肝炎治疗,不过其市场表现平平。
1990年,InterMune公司上市了第一个rh IFN-γ产品Actimmune,用于慢性肉芽肿病,重度恶性骨骼石化症等疾病的治疗。
1993年,Bayer公司上市第一个rh IFN-β1b产品Betaseron,用于多发性硬化症(MS)的治疗。
2001年,FDA批准Schering Plough公司的长效干扰素——聚乙二醇IFN-α 2b,使得给药频率减少为1周1次。
2014年7月和8月,Biogen Idec公司的长效IFN-β 1a产品Plegridy(聚乙二醇干扰素β-1a)获欧盟和FDA批准上市,用于治疗成人多发性硬化症(MS),其剂量为每两周一次。;;;第二大重组蛋白;五巨头垄断全球干扰素市场;受新型竞争药物冲击;疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α;疾病谱差异导致国外IFN-β国内IFN-α;国内干扰素新药的研发情况; 取保存工作种子批菌种,室温融化
摇瓶活化培养:30℃,pH7.0,250 r/min,18±2h
检测:OD值和发酵液杂菌检查。; 接种:接入30L种子罐,接种量10%
培养:30℃,pH7.0
控制:级联调节通气量和搅拌转速
DO为30%,3~4h,OD4.0
检测:显微镜和LB培养基划线检查,控制杂菌。; 接种:通入300L培养基的发酵罐,接种量 10%。
控制:级联调节通气量和搅拌转速。
前4h:30℃,pH7.0,DO为30%
4h后:20℃,pH6.0,DO为60%,5~6.5h
终点控制:OD值达9.0±1.0,5℃冷却水快
速降温至15℃以下
检测:发酵液杂菌检查; 连续流离心机:冷却的发酵液,16000 r/min离心收集。
菌体保存:-20℃冰柜,不超过12个月。
检测:干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、
质粒结构一致性、质粒稳定性。; 种子培养基:C/N比较低的培养基
发??培养基:C/N比较高的培养基
pH控制:加入缓冲体系; DO:高时,产物明显提高;同时质粒的稳定性提高
策略:加大转速,增加通气量,必要时用纯氧; 温度:要考虑菌体生长和产物的积累
策略:前期控制在30℃,保证菌体快速生长,后期控制在
20℃积累产物,同时防止产物降解; 菌体生长:pH 6.8
产物积累:pH 6.0
策略:两段培养
; 裂解缓冲液:纯化水,2℃~10℃(pH7.5)
使用保护剂:EDTA、DTDE、PMSF
破碎-20℃菌体:2厘米
搅拌:加裂解缓冲液,2℃~10℃,2hr
冻融: 细胞完全破裂,释放干扰素。; 加絮凝剂聚乙烯亚胺:2℃~10℃,搅拌,对菌体碎片
进行絮凝。
加凝聚剂醋酸钙溶液:2℃~10℃,搅拌,对菌体碎
片、DNA等进行沉淀。
离心:
连续流离心机:2℃~10℃,16000 r/min
收集上清液:含有重组干扰素蛋白质
杂质沉淀:121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。; 盐析: 4M硫酸铵,2℃~10℃,搅匀静置过夜。
离心:连续流离心机,16000 r/min
保存:收集沉淀,粗干扰素,4℃。;1、溶解粗干扰素 ;2、沉淀与疏水层析 ;2、沉淀与疏水层析;3、阴离子交换层析与浓缩;4、阳离子交换层析与浓缩;5、凝胶过滤层析;6、无菌过滤分装;7、检测项目
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