实验六 原生质体的分离(周二组、周三第二组).ppt

第二组：1 % 纤维素酶 + 0.75 % 果胶酶 + 7 %甘露醇 1.5 %果胶酶20 mL ：0.3 g果胶酶溶于20 mL 7 % 甘露醇中。 20 mL 2 % 纤维素酶与20 mL 1.5 % 果胶酶溶液混合，分装成24管，其中12管每管2 mL,12管每管1 mL。 第三组：1 % 纤维素酶 + 1 % 果胶酶 + 7 %甘露醇 酶液配制方法： 2 %果胶酶10 mL ：0.2 g果胶酶溶于10 mL 7 % 甘露醇中。 10 mL 2 % 纤维素酶与10 mL 2 % 果胶酶溶液混合，分装成12管，其中6管每管2 mL,6管每管1 mL。 原生质体分离观察： 在血球计数板上分别滴一滴紫叶甘蓝原生质体，在显微镜下观察，统计原生质体个数填入表中。 对每个样品计数3次，记为重复1，2，3，取其平均值。 计数时，如果为16×25规格的计数室，取四个角的中格（即100个小格）计数。如果为25×16规格的计数室，取四个角的及中间的中格（即80个小格）计数。 对每个样品计数3次，取其平均值，按下式计算每毫升原生质的个数： 16×25规格的计数板： 原生质体数/mL =100小格内原生质体数/100×400×104 25×16规格的计数板： 原生质体数/mL =80小格内原生质体数/80×400×104 （二）注意事项 1、选择适宜种类的酶 分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和 果胶酶。 2、酶液渗透压 分离原生质体酶液的渗透压应大致和原生质体内的相同。 3、植物材料的生理状况 要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力 强的组织材料。 4、酶溶液的pH值 对原生质体的产量和生活力影响很大。一般为5～7。酶的 活性与pH值有关。Onoznka纤维素酶R-10最适宜pH值为 5～6。不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不 同的，应通过实验确定。 5、酶解温度 对酶解效率和植物原生质体的活力都有影响。适于植物材 料的温度一般都在25 ℃，所以一般在25 ℃左右进行酶解。 一、实验原理及意义（略） 二、试剂（略） 三、理论依据：见文献综述 四、实验方法与步骤及注意事项 （一）实验方法与步骤 1、查阅文献，撰写综述，设计实验方案 2、 蒲包花的购买与养护管理 3、试剂配制 4、原生质体分离 （二）注意事项（略） 材料处理方法 在两个5 mL离心管中分别加入2 mL 酶液，一份酶解黄色花瓣，一份酶解红色花瓣。将红色和黄色蒲包花花瓣切成宽约2 mm的小条（一端不断开，便于操作），分别加入到两个离心管中，酶解4-5小时。将酶解后的材料用300目的尼龙网过滤，收集滤液(过滤可省去)。 原生质体分离观察： 在血球计数板上分别滴一滴蒲包花原生质体，在显微镜下观察，统计原生质体个数填入表中。 对每个样品计数3次，记为重复1，2，3，取其平均值。 * * 辽宁师范大学生命科学学院本科生综合性、设计性实验报告 实验题目：实验六 植物原生质体的分离 （一）紫叶甘蓝原生质体的分离 一、实验目的与意义 植物原生质体在生理生化研究、基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合、新品种培育等方面有重要用途。 通过本实验，提高文献查阅、综述写作、植物材料培养、试剂配制等方面能力，并掌握原生质体分离的方法。 二、实验设备、试剂及材料 设备：恒温水浴锅、普通光学显微镜、倒置显微镜、电子天平、称量纸、移液管、容量瓶、烧杯、吸耳球、玻璃棒、磁力搅拌器等。 试剂：纤维素酶、果胶酶、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、甘露醇、 蒸馏水等。 紫叶甘蓝种子 三、理论依据：见文献综述 四、实验方法与步骤及注意事项 （一）实验方法与步骤 1、查阅文献，撰写综述，设计实验方案 2、 紫叶甘蓝籽苗的培养 3、试剂配制 4、原生质体分离 1、0.1 M pH5.7的磷酸钾缓冲液500 mL 0.2 M A液：称取13.6 g KH2PO4，溶于400 mL蒸馏水中，定容至500 mL。 0.2 M B液： 称取2.28 g K2HPO 4（0.2 mol/L），溶于40 mL蒸馏水中，定容至50 mL。 467.5 mL A液+ 32.5 mL B液混匀，即为500 ml pH5.7 磷酸钾缓冲液。 2、甘露醇溶液 根据各组浓度设计配制。 3、纤维素酶液与果胶酶溶液 根据各组浓度设计现用现配。 实验设计： 第一组：1 % 纤维素酶 + 0.5 % 果胶酶 + 7 % 甘露醇 酶液配制方法(酶液量可根据每组人数做适当调整）： 2 % 纤维素酶50 mL : 1 g 纤维素酶溶于 40 mL 7 % 甘露醇 中，定容至5