磁珠分选肿瘤干细胞操纵规程.docVIP

肿瘤干细胞的分选工作 一、消化4 _- t% a) c7 M } T) j4 _0 B （1）取出肿瘤组织，低温保存（离体组织冰上最多能保存多久仍可以用来分离CSCs？） （2）PBS漂洗，尽可能去除血细胞; ^9 B {6 G. W% b1 a （3）放在DMEM/F12中尽量剪碎或剁碎组织（4）用胶原酶和透明质酸酶37°C? ?摇床中消化一小时（透明质酸酶是否必要？）（5）慢速离心，去上清。??DMEM/F12混悬沉淀，（6）过滤（请问40微米筛是否可以？）。（7）滤液用histopague-1077去除红细胞（据文献报道，请问是否有必要？）（8）离心，沉淀用无血清CSCs培养液混悬。接着进行分选（请问细胞养一天影响大不大？） 二、分选（据文献看流行的做法是磁珠分选，再流式检测纯度）? ?（1）负选：去除CD45标记的血干细胞及CD117、FAP标记的间质细胞（请问各位大侠是否做这一步？）9 [) J( @: V0 r: c( W? ?（2）正选目的细胞 磁珠分选步骤??G8 a# a7 @! r6 _ 试剂和设备：0 N3 Y( x) I. d. C2 JBuffer：无Ca，Mg离子的PBS，PH 7.2, 含0.5%BSA，2mM EDTA, 是用autoMACS稀释液（美天旎货号＃130-091-222）稀释MACS BSA储备液（＃130-091-376）制成，保持Buffer冰冷（4－8℃），使用前脱气，避免气泡堵塞分选柱。 一．磁性标记2 z Q% ^/ i??u1 M保持细胞冰冷，108或小于次数的细胞则使用下述体积试剂，磁性分选前获取较佳的单细胞悬液，可以将细胞通过40um尼龙筛，去除可能阻塞分选柱的细胞团块。高温和延长孵育时间会导致非特异性细胞标记。+ ` # K A* G! w! P* p* W/ ~) U 1.?细胞计数2.?300×g离心细胞悬液，尽量去除上清3.?用350 uL buffer重悬4.?加100 uL FcR 封闭试剂5.?加50 uL CD133/1(AC133)-Biotin6.?充分混合后冷处孵育10分钟（4－8℃）% ]2 H5 h: z9 B. w4 N7.加50uL PE连接CD133抗体（#130-090-853）遮光冰箱孵育5分钟( i: k; I2 K( T8.用10-20倍标记样体积的buffer洗细胞300×g离心10分钟。充分洗,去上清。9.?重复清洗细胞10.?用400uL buffer 重悬细胞5 }/ `; E( w/ @: @11.?加100 uL抗生物素微珠12.?充分混合冰箱孵育15分钟3 t- |* k) r* \$ m( k13.用10-20倍体积buffer洗细胞并300×g离心10分钟，充分吸去上清 c4 B7 }# V: 14.?用500uL buffer 重悬细胞15.?继续磁性分选步骤 二．磁性分选1 n: k H+ ~! ^4 q q8 o 1.?安装分选柱+ Z8 f$ a% b1 i3 ^! J2.?用500uL buffer冲洗分离柱3.细胞悬液上柱4.?收集过柱的未标记细胞，用适量Buffer洗柱子，洗三次，每次等柱内Buffer流干再加，MS柱：3×500uL， 收集总流出液。这部分就是未标记细胞组分5.?将MS柱从分离器上取下，放在新收集管上6.加1mL buffer 到分离柱中，立即用活塞坚定地吹洗出磁性标记的细胞7.要想进一步纯化CD133＋细胞，洗出的细胞可再次上柱，即用新分离柱重复1－6 步骤注意：所有过程在超净台和冰上进行以保证细胞活力1．用冰预冷的MACS buffer 重悬108胶质母细胞瘤细胞2．用冰预冷的MACS buffer 洗几次: ~) y/ Q Q: g/ h3．?4℃下在90uL 冰预冷的MACS buffer中用PE－连接的CD133抗体10uL 与5×105细胞结合30分钟（抗体浓度需要被调整） {2 ?9 K H- e4．用MACS buffer洗几次细胞! r# o b q4 o* x0 l6 ? N5． 4℃用微珠连接的抗PE的抗体处理细胞30分钟（20uL微珠连接PE抗体/5×105在80uL冷MACS buffer中）7 p9 C J1 s/ n0 q i1 S }9 R6．用冷MACS buffer洗几次细胞7．用500uL 冷MACS buffer重悬抗体黏附的胶质母细胞瘤细胞 u4 @- 8．附图，准备MS柱9．细胞悬液上柱10．收集过柱的未标记细胞，用500uL 冷MACS buffer 洗MS柱三次，每次当柱内积液干时加buffer，收集总流出液为未标记细胞部分2 v7 ?;