第三节原核生物分子克隆载体.doc

第三章 分子克隆载体 §3.1 质粒载体 质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。 质粒DNA分子大小 ：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。 质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系：一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。 一、质粒的一般特征 1.质粒DNA编码的表型 质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%，但却编码着重要的遗传性状： a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。 b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；…… c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成； 2.质粒DNA的转移 ①接合型质粒和非接合型质粒 *接合型质粒(conjugative plasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因； *非接合型质粒(non- conjugative plasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。 ②质粒DNA的转移过程 质粒自主转移 质粒的辅助转移 质粒的重组转移 3.质粒DNA的复制类型 根据寄主细胞中所含拷贝数的多少，讲质粒分为： ①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的质粒(stringent plasmid)：每个寄主细胞中仅含有1-3份拷贝； ②高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：每个寄主细胞中可高达10-60份拷贝。 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对的，它的复制不仅受自身的制约而且还受到寄主的控制 4.质粒的不亲和性 ①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。 注意：只有当有确切的证据表明第二种质粒B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。 ②不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。 同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近，以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不亲和 pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不亲和 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不亲和 ③质粒不亲和性的分子基础 质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的： *ⅰ. 负反馈调节环(negetive feed-back loop)：大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。 ⅱ.同一个细胞含两种相容质粒，由于亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。于是这两种质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。 *ⅲ.同一细胞含两种不相容的质粒，亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。 *ⅳ两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。 二、质粒DNA的复制与拷贝数的控制 1．ColE1质粒DNA复制调节的机理 许多的质粒载体都是由ColE1质粒派生的。 ColE1质粒的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环型DNA单向进行。RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1 DNA转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小