细胞凋亡及检测原理.ppt

细胞凋亡与检测方法 细胞坏死 （细胞被动性死亡） 细胞受到急性强力伤害时，立即出现的早期反应。是病理条件下细胞死亡的过程。 细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。 核染色质随机降解呈絮状, 蛋白合成减少。 细胞膜、溶酶体破裂, 细胞内容物流出,引起周围炎症 细胞凋亡 （细胞主动性死亡） 多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基 因控制的细胞主动性死亡过程。又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD). 从严格的词学意义上来说，PCD与凋亡是有很大区别的 二、细胞凋亡的检测方法 (二) 形态学方法 借助普通光学显微镜，荧光显微镜或透射电镜对培养细胞，细胞涂片或者组织切片进行形态学观察。细胞凋亡的形态特征分为3部分： 凋亡的起始 凋亡小体的形成 凋亡小体被邻近细胞或吞噬细胞吞噬清除 下面以碧云天生物技术公司生产的细胞凋亡-hoechst染色试剂盒为例 （三）电泳法 在细胞凋亡时，内源性mg2+、ca2+依赖性核算内切酶被激活，对DNA的切割有3种形式。即核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂以及DNA单链的断裂。用胰酶消化体外培养细胞，经PBS洗涤，用蛋白K消化，酚-氯仿抽提凋亡细胞的基因组DNA，取5ug琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察可见特征的‘梯状’（ladder）DNA条带。 该方法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系 （四）原位缺口末端标记法 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL)是一种用来检测细胞凋亡(apoptosis)的分析方法.细胞凋亡有一项重要的特征为细胞内的DNA碎裂成片段(DNA fragmentation), TUNEL可以有效的去探测DNA片段的产生,所以可以传达细胞凋亡的讯息. 原位末端标记技术可以检测到形态改变之前的凋亡细胞，敏感性高，特异性强，为凋亡细胞计数提供了基础 （五）流式细胞术测定法 利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或者生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。 流式细胞仪的工作原理和基本结构 待测细胞以单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色，放入样品管，吸入流动室。 流动室充满IsoFlow ，作用：约束样品在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。 细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境稳定的方面起到十分重要的作用。Annexin V 是一种分子量在35-36kD的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）高亲和力特异性结合。以标记FITC的Annexin V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 PI(Propidium iodide)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过而使细胞核染成红色。将Annexin V 与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞分开。 谢谢  请大家批评指正 * * * * 目录 一 细胞凋亡的定义 二 细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡 生理性凋亡 病理性凋亡 由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细胞死亡（programmed cell death, PCD） 非遗传控制的的意外的细胞坏死（accidental cell death） 定义：凋亡 定义：细胞坏死 细胞坏死 细胞凋亡 形态学方法 电泳法 原位缺口末端标记法 流式细胞术测定法 碧云天生产的细胞凋亡－Hoechst染色试剂盒(Hoechst Staining Kit) 提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。典型的Hoechst 33258染色后的细胞图片参考下图。 正常细胞核??? 刺激后有致密浓染的凋亡细胞 图为：BECKMAN COUTER FLOW CYTOMETER 试剂盒采用赛宝生生物技术Annexin-v-FITCF凋亡检测试剂盒   散点图 密度图 二维等高图 直方图 * * * * * *