Bac-to-Bac_表达系统精简.doc

Bac-to-Bac 表达系统I. pFastBac-X重组质粒的构建利用分子生物学技术构建所需的pFastBac重组质粒,以DH5α为宿主,进行扩增.(以下以pFastBac-X为例进行说明.II. pFastBac-x重组质粒的转座步骤：1.??制备LB琼脂平板。LB培养液（含Agar）：胰蛋白冻10g/l，Nacl 10g/l，酵母提取物 5g/l，Agar 15g/l高压灭菌后，培养基温度下降至60℃左右迅速加入下列成分：卡那霉素 50ug/ml庆大霉素 7ug/ml四环素 10ug/mlBluo-gal 100ug/mlIPTG 40ug/ml各成分混匀后，乘热在每块平板中加入约20ml培养基，待凝固后放置37℃烘箱干燥产生的水汽。2.??取出DH10BacTM感受态细胞冰上融解。3.??用移液枪吸取100ulDH10BacTM感受态细胞于1.5ml EP管。4.??轻轻加入1ng（约5ul）重组质粒X于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。5.??冰上放置30min。6.??42℃循环水浴静止45秒。7.??快速放置冰上2min。8.??在上述管中加入900ul S.O.C.培养基。9.??将EP管置于37℃摇床（225rpm）4h。10.??用S.O.C.稀释上述细胞至10－1、10－2、10－311.??在每块LB培养基中加