使用小体积凝胶过滤快速筛选膜蛋白纯化缓冲液.PDFVIP

应 使用小体积凝胶过滤快速筛选膜 用 园 地 蛋白纯化的缓冲液 H. M. Eriksson1, 2和L. Kaiser2 1 生物化学和生物物理学系，斯德哥尔摩大学，斯德哥尔摩，瑞典 2 生物医学工程中心，, 马萨诸塞州技术研究所，剑桥，MA ，USA 缓冲液组成的优化，如盐、还原剂和去污剂，对于 可以每天进行多轮运行和有效的缓冲液追踪。 蛋白质纯化尤其是膜蛋白纯化十分重要。现已开发 小的柱床体积也能够减少所需要的缓冲液量， 了一种使用Superdex™ 200 5/150 GL凝胶过滤层析 从而减少昂贵的去污剂量。 柱的方法比较不同缓冲液组成对两类膜蛋白的蛋白 均质性的影响。小体积的层析柱减少了样品的体 我们提出一种使用3 ml Superdex 200 5/ 150 GL凝 积、缓冲液的消耗和运行时间，最终降低了使用昂 胶过滤层析柱的有效的方法，用以监测不同缓 贵的去污剂的成本，并产生更高的通量。 冲液组成如盐、还原剂和去污剂的影响。目标 蛋白是一个七次跨膜G蛋白偶联受体(GPCR) ，Mr 介绍 32000和一个膜结合糖基转移酶受体(GT) ，Mr 膜蛋白是蛋白质结晶的富有挑战性和令人振奋的 45000 。 候选蛋白，但是必须使疏水性膜蛋白稳定在水溶 液中，这要求我们仔细地研究不同的包含去污剂 蛋白质表达和分离 的缓冲液组成，以确定蛋白质为单分散性的和稳 使用添加一种去污剂(FC14, Anatrace Inc., USA)的 定的条件。 麦胚无细胞抽提物( Roc he Diag nost ics Co rp., USA)表达的GPCR带有Rho标记并以可溶性形式 鉴定不同缓冲液组成对蛋白质功能性影响的最终 存在。带有组氨酸标记的GT蛋白在大肠杆菌中 技术是蛋白质活性分析。然而，这通常很难开 表达，膜组分在4 ℃下135000xg离心60分钟条 发，而且现有的技术不适用于所有的膜蛋白，特 件下收集。通过添加去污剂溶解膜颗粒并在4 ℃ 别是当蛋白质从膜上溶解时(1，2) 。活性分析的一 下孵育2小时。在4 ℃下20000Xg离心30分钟去