苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因cry6Aa的表达负调控及杀线虫晶体蛋白进入根结线虫体内的模式.pdf

摘 要 苏云金芽胞杆菌(Bacillus 菌，在芽胞形成期产生的晶体蛋白对许多昆虫有毒力，因而被广泛用作害虫的生物 防治。近些年来发现其对线虫也有毒力。本文从苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的 防治效果、杀线虫晶体蛋白基因表达调控和晶体蛋白对植物寄生线虫的作用方式等 方面研究了苏云金芽胞杆菌对植物寄生线虫的作用。 1．测定了苏云金芽胞杆菌YBT-1532菌株对根结线虫毒力及防治效果。该菌株携带 也对线虫有很高的毒力。分别测定该菌株产生的晶体蛋白和苏云金素对北方根结线 虫(Meloidogynehapla)二期幼虫的毒力，发现它们都表现出了很高的毒力，其LC50 方根结线虫的防治效果。结果显示，在盆栽条件下该菌株可以有效抑制北方根结线 虫对番茄的感染、降低根组织上根结数量、产卵量以及土壤中的虫口密度。我们还 进行了防治花生根结线虫(Marenria)的田间初步实验，该菌株对花生根结线虫并没 有表现出明显的防治效果，但是可以使花生增产6％左右。 因下游还有一个基因D，口，两基因之间存在一个茎环。处在两基因之间的茎环抑制 D啦的表达，使之处于一个相对较低的表达水平。当突变D啦时，cry匠4a2基因表 显著提高；当去掉茎环结构时，ode得到大量表达，cry6Aa2表达水平急剧降低，这 达的蛋白质能结合到茎环上。所有实验结果表明，在克隆的操纵子当中，茎环抑制 调节基因off2的表达，而调节基因0,／2表达的蛋白质结合到茎环上，这可能打开茎 达，从而实现对cry6Aa2表达的负向调控。在苏云金芽胞杆菌中，存在着许多正向 调节因子来提高杀虫晶体蛋白基因的表达，而像本研究中orfe这种负向调节因子还 比较少见。本研究发现了一个新的晶体蛋白基因表达负向调控模式，为提高晶体蛋 白表达量提供了一条新的途径。 3．初步研究了晶体蛋白进入根结线虫体内的方式。由于植物寄生线虫大多专性寄 生，主要依靠其刺吸式口器一口针从植物细胞内吸取细胞内含物的方式来取食，晶 体蛋白很难通过其口针直接进入体内。但是许多研究结果表明，伴胞晶体蛋白的确 能够对植物寄生线虫表现出毒力，那么，苏云金芽胞杆菌晶体蛋白是如何进入植物 寄生线虫体内并且发生毒力作用的呢?本文以北方根结线虫为作用对象，Western blot检测发现溶解的晶体蛋白毒素Cry6Aa2的确可以通过某种方式进入根结线虫体 内，并且与线虫体内的毒素受体结合，使得毒素分子量明显增加；而用CrySB毒素 感染根结线虫，从线虫体内也能检测到该蛋白，但是发现该蛋白被降解成大约70 异。用对线虫无毒力的小分子量蛋白Cry51Aal作用根结线虫时，同样能从其体内 检测到该蛋白，但是分子量没有任何变化。用罗丹明标记的Cry6Aa2毒素作用根结 线虫，激光共聚焦扫描显微镜观察发现，’荧光信号首先出现在线虫体表，随着作用 时间的延长，线虫体内才开始出现荧光，而且荧光信号从最初的弥散状态逐渐集中 到其肠道组织上。在作用过程中，线虫的口针自始至终都没有荧光出现。该实验结 果表明，毒素蛋白可能是通过线虫体壁进入根结线虫体内，然后作用线虫的肠道组 织。本实验初步研究了晶体蛋白毒素对植物寄生线虫地作用方式，为利用苏云金芽 胞杆菌防治植物寄生线虫提供理论支持。 关键词：苏云金芽胞杆菌，植物寄生线虫，伴胞晶体蛋白，cry基因表达调控，作用 机制 n Abstract Bacillus awell—known and soil thuringiensis(Bt)isgram-positivespore-forming bacteriumthat the ofits parasporalcrystalprotein spomlation produces during phase exhibits to itwas growth crystalprotein high insects，S