细胞自噬检测.docVIP

2.5细胞裂解 细胞从培养皿上被刮下来之后，在15ml灭菌塑料试管中用PBS洗涤3次，每次洗涤用10mlPBs充分重悬细胞，在4“c下5009离心5min。所有操作在冰上进行。最后一步洗涤把细胞转移到1.smlePpendorf管中。把细胞充分重悬在TAP细胞裂解液中。根据细胞量决定裂解缓冲液的体积(一般每10川细胞用100川一200川TAPBu价r)。放置于冰上30min，每10min用移液枪吹打细胞一次使之充分悬浮。在4OC下用100009高速离心15min，把上清转移到新的试管中进行下一步实验，丢弃沉淀。 2.13细胞自噬活性的检测 我们主要通过两条途径来诱导细胞发生自噬，一饥饿处理，二药物RaPamycin处理。对 于饥饿处理，吸去正常培养的细胞中的培养液，用PBS小心洗涤细胞三次，注意不要使细 胞脱离培养皿，加入15mlEBss(用量根据培养皿的大小而定)连同2林M的ED64和pePstatin。 在37“C培养箱中培养2一4h。对于RaPamycin处理，在普通细胞培养液中加入终浓度为 500nM的R叩amyein(sigma)37“e下培养12h。细胞自噬活性的检测主要有两条途径，一 条是通过转染GFP一LC3，再用荧光显微镜观察LC3在细胞质中的聚集。二是用westemblotting和LC3的抗体，检测细胞内源LC3n的增加。对于荧光显微镜分析，在U20S细胞中