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重组鲎C 因子sushi蛋白中内毒素结合位点的确定和sushi多肽对内毒素的中和作用NGUAN SOON TAN,* MIANG LON PATRICIA NG,* YIN HOE YAU,*POOI KAT WILLIAM CHONG,* BOW HO,? AND JEAK LING DING*,1*Department of Biological Sciences, ?Department of Microbiology, National University of Singapore,Singapore 117543摘要：作为生物活性分泌重组蛋白产生的C因子，含有不同的sushi蛋白结构域，其三个截短的片段分别为sushi 123，sushi 1和sushi 3结构域。sushi 1和3各有一个Kd 1029~10210 M的高亲和力LPS结合位点，sushi 123的正协同效应会在Kd 2中增加1000倍。sushi 1和3的核心LPS结合区域存在于两个34-mer肽，S1和S3中。一个二硫键结构的牢固结合不是必需的，但是对于LPS结合是十分重要的，正如所确认的亲和性下降了100~10000倍。S1和S3都能以不同的效价，抑制LAL反应和LPS诱导的hTNF-α的分泌。LAL试验显示，至少有两分子的S1按2.42的Hill系数共同结合到一个LPS分子上，而被S3结合的LPS则是独立进行，无需协同的。经过修饰的SD1和SD3肽展现出增强的LPS中和潜能，尽管它的亲和力只表现出10倍的提高。因此，在不改变它们对LPS的结合亲和力的条件下，四个sushi多肽的结构差异赋予了LPS不同的中和作用效率。圆二色谱测定显示出类脂A中存在四肽构象的变化，即从一种无规卷曲转变成α螺旋或β折叠结构。C因子对LPS的灵敏度有两个关键因素：1)单个的C因子分子上存在多个LPS的结合位点；2）LPS结合的高正协同效应。结果表明，在改进LPS的结合和中和肽的设计中，除了它的结构之外，其电荷平衡也是一项关键参数。关键词：鲎变形细胞溶解物；类脂A；果蝇S2细胞；脂多糖内毒素也被称为脂多糖(LPS)，它是革兰氏阴性菌外层的主要组成部分，并具有重要的病理生理功能。在被革兰阴性细菌感染时，LPS是宿主防御系统的体液免疫和细胞组分的重要激活剂，激活宿主防御来对抗这类感染是有必要的，但不受控制的刺激可能导致过度地释放炎症细胞因子，引起感染性休克和死亡。由内毒素的中和作用介导的毒性损伤，在很长时间内一直被认为是可能的治疗患者的药物作用靶点。在LPS分子中，存在三种遗传特性、生化特性和抗原性不同的区域：O-特异多糖侧链、核心多糖和类脂A。O-特异侧链由高度可变的重复低聚糖单位组成，它具有免疫原性，并能产生大量的血清，当O-抗原丢失时核心糖脂将会暴露，虽然在结构上相比O-抗原的可变性较低，但它仍然出现在许多类型的肠杆菌科细菌中（例如，沙门菌属）。LPS的促炎症生物活性存在于结构上最保守的葡萄糖胺基的磷脂上，即类脂A。因此，内毒素的中和作用通过类脂A，体现了一个治疗这种复杂的临床综合症，合理的、多层面途径的重要方向。我们在鲎变形细胞溶解物(LAL)中发现，溶液中只要有微量的LPS就可以激活凝血级联。三种丝氨酸蛋白酶原——C因子、B因子、凝血酶原和一种凝固蛋白、凝固蛋白原——已经被纯化并赋予某些特征。当LPS存在时，对LPS敏感的C因子，丝氨酸蛋白酶原会自催化激活，然后激活的C因子能够激活B因子酶原以激活B因子，随后激活凝血酶原以激活凝血酶，由此产生的凝血酶会将可溶性的凝固蛋白原（一种无脊椎动物的纤维蛋白原样物质）转换为不溶的凝固蛋白凝胶。作为凝血级联的最初激活物，C因子的功能是作为一个生物传感器，来响应LPS或类脂A。可想而知，C因子具有的LPS结合域展示出了对类脂A的异常高亲和性。所以，来自于C因子的LPS结合域将会结合并中和类脂A的生物毒性，并能与其他细菌的LPS发生交叉反应，因此可应用于感染革兰阴性细菌的败血症患者的免疫治疗。我们的实验室已经从Carcinoscorpius rotundicauda(CrFC)中克隆出与C因子同源的cDNA。C因子是一种新型的包含5个sushi结构域的镶嵌蛋白，分别为一个表皮生长因子样、一个C型凝集素样和一个丝氨酸蛋白酶的结构域。除了这些结构域，一个富含半胱氨酸和一个富含脯氨酸的区域，也分别在H链的NH2末端和COOH末端被发现(图1)。最近，我们已经建立了带有多个类脂A结合位点的CrFC的氨基末端片段，还表达并赋予了一种分泌型CrFC的氨基末端区域一些特征，称为SSCrFCES。这种38kDa的蛋白质表现出了C因子的LPS结合域的高亲和力，并以2.2的Hill系数展现出与多个类脂A分子结合的高正协同性。SSCrFCES能够抑