具有增强蛋白质表达活性序列ER3的筛选及其功能区域的初.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（３）：１８２４ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 具有增强蛋白质表达活性序列ＥＲ３的筛选及其 功能区域的初步鉴定    崔成成 　毕艳红 　王应明　李　攀　杨思达　黄　芬　曾韦锟　井申荣 （昆明理工大学医学院　昆明　６５０５００） 摘要　目的：利用构建的增强子样序列筛选载体，筛选在大肠杆菌中增强外源蛋白质表达的序 列，并利用删除突变体初步鉴定其功能区域。方法：以氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）基因序列与人乳 头瘤病毒（ＨＰＶ）主要衣壳蛋白基因Ｌ１的截短序列Ｌ１１连接作为报告基因，从采集的样品中筛选 增强子样序列，通过蛋白质表达来检测其增强活性，并通过构建删除突变体来初步鉴定其功能区 域。结果：成功筛选到一条增强子样序列，可使检测载体氯霉素抗体提高１１倍，融合蛋白表达水 平提高２．２６倍，其功能区域主要集中在 １～２６５ｂｐ。结论：从收集的样品中成功筛选出一个增强 子序列，能提高外源基因在大肠杆菌中的表达。 关键词　增强子样序列　增强基因表达　删除突变体　功能区域 中图分类号　Ｑ９３９．９３ 　　增强子（ｅｎｈａｎｃｅｒ）是基因表达调控过程中的一段 酶切基因组，将小于５００ｂｐ的ＤＮＡ片段插入检测载体， ＤＮＡ序列，通过与启动子相互作用增强目的基因的转 构建基因文库，通过氯霉素抗性筛选含增强子样序列 录。该序列可位于启动子上游或下游，且不受距离影 的菌株。通过检测报告基因的表达量，验证了增强子 ［１］ 响，可对异源性启动子发挥作用。自Ｂａｎｅｒｊｉ等 于 样序列增强外源基因表达的作用。应用序列测定、分 １９８１年在真核病毒 ＳＶ４０基因组中首次发现此类增强 析及突变体研究等手段，初步确定了其功能区域，为该 子序列后，相继在其他病毒及真核基因组中也发现有 增强子样序列的研究和应用奠定了基础。 ［２３］ 大量增强子的存在 。近年来，由于原核表达系统的 应用越来越广泛，对其基因表达调控的研究也更加深 １　材料与方法 入，发现在原核表达系统中也存在类似于真核转录增 １．１　材　料 强的作用机制［４６］ ［７］ 。韩峰等 从大肠杆菌基因组中筛 １．１．１　主要试剂　限制性内切核酸酶Ｎｄｅ、ＢａｍＨ 、 Ⅰ Ⅰ 选到一个原核增强子样序列３Ａ，可提高干扰素基因表 ＢｇｌＩＩ和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＴａＫａＲａ公司；ＴａｑＤＮＡ 达水平；从痘苗病毒天坛株基因组中筛选到两个原核 聚合酶、ｄＮＴＰ、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自天根生化科技（北京） 增强子样序列ＶＶ１和ＶＶ１６，在大肠杆菌表达系统中能 有限公司；质粒小量快速提取试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂 够在转录水平提高ｌａｃＺ基因的活性；同时，携带有痘病 盒购自北京庄盟生技术有限公司；异丙醇，无水乙醇， 毒增强子样序列的表达载体也能够提高干扰素基因表 ＩＰＴＧ等其他试剂均为国产分析纯试剂。 ［８］ 达水平 。